30K蛋白对家蚕细胞及幼虫存活作用.docVIP

30K蛋白对家蚕细胞及幼虫存活作用 　　摘要利用杆状病毒表达系统在家蚕Bombyx mori L.细胞BmN中表达家蚕30K蛋白，以亲本病毒BmPAK6为对照，将重组病毒Bm/r-30K分别感染BmN细胞及家蚕幼虫，观察其感染后不同时间的凋亡及存活率。与对照相比，重组病毒感染后的BmN细胞的存活率明显高于对照组，并且感染的家蚕幼虫存活时间也较长，表明体内过量表达家蚕30K蛋白有助于延长其细胞及幼虫的存活。 　　关键词　家蚕，30K蛋白，杆状病毒，表达，生长 　　 　　昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于表达重组蛋白，然而杆状病毒感染昆虫细胞后会导致细胞的死亡。因此，虽然高密度昆虫细胞成为杆状病毒感染后高效表达外源基因、获得最大量的重组蛋白的基础，细胞的存活率及寿命却是影响包含外源基因的杆状病毒复制的重要因素。家蚕Bombyx mori L.，血清具有抑制昆虫细胞凋亡的作用。在昆虫细胞培养基中添加家蚕血清，可以通过抑制宿主细胞的凋亡而提高杆状病毒表达系统中重组蛋白的产量。家蚕的血清还可以抑制哺乳动物的凋亡，表明家蚕血清包含有抑制凋亡的成分。研究表明家蚕血清中抑制凋亡的成分包括30kD和70 kD两类蛋白质，对其中抑制凋亡作用最强的蛋白质进行质谱分析，该蛋白与一种功能未知的低分子脂蛋白同源性高达95％，分子量约为30 kD。细胞凋亡的研究已表明Bcl-2家族及抑制凋亡蛋白家族(inhibitor of apoptosisprotein，IAP)具有抗凋亡作用，而家蚕30K蛋白的氨基酸序列与Bcl-2家族、IAP家族蛋白等没有任何同源性。本试验在前期报道的基础上，构建了含有克隆鉴定的家蚕30K基因的重组杆状病毒转移载体pFastBacHTb-30KC19，利用Bac-to-Bae方法获得了家蚕30K重组病毒。以亲本病毒为对照，将30K重组病毒感染家蚕细胞及幼虫，研究30K蛋白的体内表达对家蚕细胞及幼虫的作用，为进一步研究30K蛋白的抑制凋亡机制提供参考。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　1.1.1质粒、菌株和细胞：感受态DHIOBac受体菌和昆虫细胞BmN由中国科学院上海生物化学与细胞研究所吴祥甫组馈赠；重组杆状病毒转座载体pFastBacHTb-30KCl9、大肠杆菌DH5a由江苏大学生命科学研究组保存；家蚕(青松×皓月由中国农业科学院蚕业研究所提供。 　　 　　1.1.2试剂：限制性内切酶和缓冲液；RNase A和Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；昆虫细胞培养基Tc-100和His单抗购自Sigma公司；胎牛血清FBS购自Gibco公司；蛋白分子量标准购自上海华舜生物工程公司；羊抗鼠IgG和TCL发光剂购自Pierce公司；其它常规试剂均为国产分析纯。 　　1.2　方法 　　1.2.1重组Bacmid穿梭载体的获得：取已构建的重组转移载体pFastBacHTb-30KC19 1 μL加入到150μL.coil DHIOBac感受态细胞中进行转化，取150μL涂布于含有X-gal(1 mg/L)、IPTG(0.8 mg/L)、庆大霉素(7/μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10 μg/mL)的LB平板上，37℃温箱倒置培养36～48 h，挑取白色单菌落，用碱法提取重组病毒DNA，以pUC/M13引物(Forward：5’-CGCCAGGGTITICCCAGTCACGAC-3’.Reverse：5’-AGCGGATAACAATTCACACGGGA-3’)，进行PCR，鉴定重组杆状病毒Bacmid-30KC19，扩增条件为：93℃变性3min后，进入以下循环：94℃45s，55℃45s，72℃，5min，30个循环，最后72℃延伸10min；蓝色菌落作为对照。 　　1.2.2 Bacmid-30KCl9 DNA转染家蚕细胞：将提取的重组Bacmid-30KCl9 DNA在脂质体的介导下转染昆虫细胞BmN，28℃培养3 d后观察细胞病变。细胞出现明显病变后，进行数次重复感染。收集细胞并煮沸裂解细胞，用30KC19基因的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，同时用Bacmid转染的Bm-N细胞作为对照，进一步鉴定重组病毒Bm/r-30KC19。 　　 　　1.2.3表达产物的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(sDS)和Western blotting分析：将重组病毒Bm/r-30KCl9感染的细胞转移到Eppendorf管中，3 000 r/min离心5 min，弃上清，加PBS洗2次后加入5倍体积的昆虫细胞裂解缓冲液，混匀，室温裂解1 min，10 000 r/min离心5 min，取上清10μL，并加入10μL SDS上样电泳缓冲液(2×)，100℃加热3～5 min。经S