α黑素细胞刺激素对EAE豚鼠外周血单个核细胞分泌IL4IFNγ水平影响.docVIP

α黑素细胞刺激素对EAE豚鼠外周血单个核细胞分泌IL4IFNγ水平影响 　　摘要：目的 通过研究α-黑素细胞刺激素（α-MSH）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）豚鼠分泌IL-4、IFN-γ水平的影响，探讨α-MSH对EAE发病有无保护作用。方法 40只雌性豚鼠分为正常对照组、EAE对照组和EAE高、低剂量治疗组。两治疗组自造模前7 d始分别按1 mg/Kg/d及0.25 mg/Kg/d予腹腔注射注射α-MSH直至试验结束。观察豚鼠神经功能障碍评分变化，测定IL-4、IFN-γ水平。结果 ①α- MSH治疗组神经功能障碍评分较EAE对照组显著降低（P0.01，P0.05），高剂量治疗组改变更明显（P0.05）。②a-MSH治疗组分泌IFN-γ水平较EAE对照组降低（P0.01，P0.01），分泌IL-4水平较EAE对照组升高（P0.01，P0.01）；a-MSH高剂量治疗组比低剂量治疗组升高或降低更明显。③各组IFN-γ/IL-4比值与与神经功能障碍评分呈正相关（P0.01）。结论 α-MSH对EAE豚鼠发病具有保护作用，其作用机制之一可能是通过剂量依赖性地调节IFN-γ/IL-4平衡发挥调节作用的。 　　关键词：α-黑素细胞刺激素；脑脊髓炎；实验性自身免疫性；白细胞介素-4；γ-干扰素 　　实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是经典的多发性硬化动物模型。目前研究认为EAE发病机制免疫失衡有关，Th1型细胞因子-γ干扰素（IFN-γ）与Th2型细胞因子白细胞介素-4（IL-4）在其发生发展过程中起着重要的作用[1]。 　　α-黑素细胞刺激素（Alpha-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH） 是一种前阿片促皮质激素原（Proopiomelanocortin，POMC）衍生肽，一系列动物实验表明α-MSH对皮炎、炎症性肠病、支气管哮喘等多种炎症性疾病具有治疗作用[2-3]，但国内尚无用于EAE和MS的相关报道。本研究试图通过观察α-MSH对EAE神经功能障碍评分及相关细胞因子的影响，探讨EAE发病及α-MSH治疗EAE的机制。 　　1资料与方法 　　1.1实验动物及主要实验试剂 250～300 g雌性健康豚鼠40只和健康SD大鼠5只； 福氏完全佐剂（complete Freuds adjuvant，CFA）、α-MSH、鼠IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒；淋巴细胞分离液[比重（1.07土0.002）g/mL]等。 　　1.2方法 　　1.2.1动物分组及处理 40只雌性豚鼠随机分为4组，正常对照组、EAE对照组、EAE低剂量治疗组、EAE高剂量治疗组，每组各10只。取SD大鼠脊髓制成脊髓冰生理盐水匀浆，再与等量福氏完全佐剂混合，反复抽打制成粗制髓鞘碱性蛋白（crude myelin basic protein，cMBP），将其注入需造模豚鼠双侧后足掌皮下各0.3 mL制造EAE模型。用PBS液稀释α-MSH成0.25 mg/mL、1 mg/mL两种浓度的溶液，EAE低、高剂量治疗组自造模前7 d始分别予腹腔注射注射α-MSH；EAE对照组及正常对照组分别同时腹腔注射等体积PBS液和生理盐水，直至实验终止。造模成功后，每天同一时间对豚鼠进行神经功能障碍评分。评分标准：无明显异常0分，后肢轻瘫1分，后肢完全瘫痪2分，后肢全瘫伴前肢不完全瘫痪3分，四肢完全瘫痪或死亡为4分。各EAE组动物均造模成功，观察3 d症状不再加重为发病高峰期处死动物；正常对照组动物4 w后处死。 　　1.2.2 IFN-γ、IL-4水平的测定 将肝素抗凝的眶静脉血分离单个核细胞，调成2×106/mL的浓度，用RPMI-1640培养液悬浮，在上述淋巴细胞悬液中加入1mg/ml的PHA，充分混匀后加入24孔培养板中，然后置于5%的CO2，37℃的细胞培养箱中培养6 h，ELlSA法检测IFN-γ、IL-4水平（按说明书方法进行检测）。 　　1.3统计学处理 采用SPSS15.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析；组间两两比较用LSD法；变量间相互关系采用Pearson直线相关分析。以P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1神经功能障碍评分 各造模组均有不同程度发病，正常对照组豚鼠未发病。EAE对照组（3.4±0.6）分，EAE低剂量治疗组（2.7±0.7）分，高剂量治疗组（2.1±0.6）分，两治疗组神经功能障碍评分低于EAE对照组（P0.05，P0.01）。EAE高剂量治疗组评分低于低剂量治疗组（P0.05）。 　　2.2各组豚鼠外周血单个核细胞分泌 IFN-γ、I