L―半胱氨酸及金属离子对马铃薯苹果甘薯多酚氧化酶活性影响.docVIP

L―半胱氨酸及金属离子对马铃薯苹果甘薯多酚氧化酶活性影响 　　摘要：以马铃薯、苹果和甘薯为研究对象，研究L-半胱氨酸和金属离子对上述3种作物多酚氧化酶（PPO）活性的影响。结果表明，L-半胱氨酸对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性抑制作用明显，随着L-半胱氨酸浓度增大，酶活性降低幅度越大，作用于马铃薯、苹果的IC50（导致酶活性下降50% 的抑制剂浓度）为0.05 mmol/L，甘薯为0.10 mmol/L。0.20 mmol/L L-半胱氨酸，使马铃薯、苹果和甘薯中PPO活性抑制率在90%以上，随着时间的延长，最大抑制率变化不大。无论是马铃薯、苹果还是甘薯，Mn2+和 Fe3+对它们的PPO活性有不同程度的激活作用，而Ca2+、Na+和Cu2+对PPO活性有一定的抑制作用。抑制作用最强的是Cu2+，3.0 mmoL/L Cu2+对马铃薯PPO活性抑制率为49.1%，对苹果PPO活性抑制率为60.8%，对甘薯PPO活性抑制率为69.7%。 　　关键词：马铃薯；苹果；甘薯；多酚氧化酶；L-半胱氨酸；金属离子 　　中图分类号： TS201.2+5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0375-03 　　收稿日期：2014-11-12 　　基金项目：河南省教育厅项目（编号：12B180002）。 　　作者简介：廖春丽（1980―），女，河南信阳人，硕士，讲师，从事微生物发酵研究。Tel：（0375）2089072；E-mail：lia163.com。多酚氧化酶（PPO） 是广泛存在于生物体内的含铜氧化还原酶，它包括单酚氧化酶、双酚氧化酶和漆酶[1]。它在动植物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起了关键作用[2]，更是果蔬酶促褐变过程中起重要作用的一种酶[3-4]。它能将酪氨酸羟化，产生3，4-二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，多巴醌自发集合且和细胞内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐色的物质，导致组织酶促褐变[5]，因此PPO 是引起褐变的关键酶。褐变问题一直是很多果蔬收获后保藏、加工等过程中导致质量下降，经济价值降低的一个非常重要的问题，因此研究防止褐变的PPO抑制剂是农产品加工需要解决的主要问题。L-半胱氨酸（L-半胱氨酸）作为一种高效安全的PPO抑制剂，在食品保鲜中的应用已有研究[6]。本研究以马铃薯、苹果和甘薯为研究对象，探讨L-半胱氨酸和金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO 活性的调控，为防止果蔬贮运加工过程中褐变提供理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　无花号马铃薯、红富士苹果、甘薯（市售）。 　　1.2方法 　　1.2.1PPO的分离纯化将在4 ℃冰箱中预冷的马铃薯、苹果、甘薯洗净后去皮，分别切块，称取100 g加入300 mL冷冻丙酮（-20 ℃），匀浆2 min，然后抽滤，滤饼再用冷冻丙酮提取，反复3次抽滤至无色，继续抽干至无丙酮味，即制得马铃薯丙酮干粉。制得干粉置于冰箱中于-20 ℃冷冻保存，使用时分别称取5 g干粉，以1 g ∶8 mL的比例溶于在4 ℃冰箱中预冷的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值6.8）中，搅拌10 min（整个试验操作都在冰上进行），然后用冷冻离心机（4 ℃）于15 000 r/min离心 15 min，吸取上清液，即得3种作物的PPO粗酶液[7]。粗酶液进一步用40%饱和度硫酸铵盐析（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），然后用冷冻离心机（4 ℃）于 6 000 r/min 离心20 min，弃除沉淀，向收集到的上清液中加入70%饱和度硫酸铵（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），最后在冷冻离心机（4 ℃）中，于 6 000 r/min 离心 20 min，收集沉淀，沉淀用4 ℃预冷的PBS溶解，得纯化的PPO酶液。 　　1.2.2PPO活性的测定参照Franceso等的方法[8-9]，作部分修改。总反应体系9.5 mL，在6 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH值6.8）的反应体系中，加入1 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚溶液为底物，置于30 ℃恒温水浴锅中保温10 min，再加入0.5 mL纯化的PPO酶液和不同量的L-半胱氨酸，30 ℃间隔1 min在475 mn波长下测定吸光度D475 nm，测定5次，每次重复3次。以不加L-半胱氨酸为对照，各处理取4 mL样品提取液进行比色。 　　1.2.3PPO活性的计算本试验以邻苯二酚为底物，在PPO催化下生成有色产物。其显色物质在475 nm处有最大吸收，吸光度在单位时间内的变化和单位酶活性成正比。制作D475 nm随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算1 min 吸光度变化值ΔD475 nm，然后以1 g鲜质量果蔬样品1 min