MiRNA―351在小鼠卵泡发育中调控作用实验.docVIP

MiRNA―351在小鼠卵泡发育中调控作用实验 　　[摘要]目的探究MiRNA一351在小鼠卵泡发育中的调控作用。方法选取60只雌性白鼠开展实验，分别于出生第5、7、11、14天和第20天处死（每次处死12只），获取卵巢后经相应处理并采取RT-PCR测定不同时刻MiRNA-351表达情况，并分析该基因表达在小鼠卵泡发育中调控作用。结果不同卵泡发育阶段MiRNA-315表达水平差异均有统计学意义（P0.05）；不同卵泡发育阶段颗粒细胞凋亡水平差异有统计学意义（P0.05）；和Mimics-351组增殖效能相比较，Inhibitor-351水平远远降低，两组间差异有统计学意义（P0.05）。结论MiRNA-351在小鼠卵泡发育各个过程中可能均有参与，且对增殖和凋亡水平均有调控作用，值得进一步深入探究。 　　[关键词]MiRNA-351；小鼠；卵泡发育；调控作用 　　雌性哺乳动物生殖过程十分复杂，并且呈现动态性周期变化。在卵巢生长发育过程中，卵母细胞生长、成熟、受精以及着床等均是维持正常妊娠必不可少的过程，而卵泡是卵巢生殖功能最为重要的部分，承担着生命繁衍的重要使命。近年来随着对人类生殖功能研究不断深入，人们对微小RNA在卵泡发育过程中作用认识也不断深入。据相关研究报道，MiRNA-351作为一种重要的调控因子，在细胞凋亡、增殖、分化等生理过程中均起着重要参与作用。为进一步探究MiRNA-351在卵泡发育中的调控作用，本研究特以小鼠模型为对象开展实验探究，旨在为卵泡发育机制研究提供理论依据。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 　　选取60只雌性小白鼠作为研究对象，均购自南京大学实验动物中心，品系为C57 black 6，批号为000659。室温条件下，12h光照、12h黑暗下饲养，自由采食和饮水，并严格控制温度、湿度、光照条件。入选标准：（1）健康雌性白鼠；（2）经我院实验动物伦理审查。排除标准：（1）未足月分娩幼鼠；（2）卵巢先天畸形，或发育异常。 　　1.2方法 　　1.2.1所有幼鼠均注射PMSG和HCG，剂量均为10IU，并于出生后第5、7、11、14天和第20天处死（每次处死12只），在显微镜下分离出小腔前卵泡（直径100～130μm），大腔前卵泡（直径200～280μm），有腔卵泡（直径450～550μm）和成熟卵泡（直径500～600μm），各15只。 　　仪器：切片机（德国Leica RM2135型）；移液器（美国Thermo Finnpipette型）；显微镜（日本Nikon 80i型）；微波炉（中国GalanzP7021TP-6型）；恒温箱（中国福马GHX-9270B-1型）；恒温冰箱（中国荣事达BCD-245F）。 　　1.2.2主要试剂和设备（1）试剂：异丙醇、无水乙醇、β-强基乙醇、氯仿、氯化钾、磷酸氢二钠等均从我院实验室领取；a-MEM培养液、胎牛血清、双抗、胰酶等均购自美国Gibco公司、mRNA分离试剂盒购自美国Qiagen公司；（2）细胞培养皿和培养板购自美国康宁公司，恒温水浴锅（杭州朗越仪器HH-501型）、酶标仪（北京普朗新9602A型）、高压灭菌锅（济南展康BKQP-75L型）、工作台由我院实验室提供、离心机（德国HERML Eppendorf 5418型）、电泳仪（美国Bio-rad 164-5070型）、超低温冰箱（中国荣事达BCD-245F）、培养箱（中国福马GHX-9270B-1型）、荧光显微镜（日本Nikon 80i型）等；（3）缓冲液配置：PBS、细胞培养液、卵泡成熟培养液以及卵泡分离液等均参照《现代实验动物学技术》中相关方法配置。 　　1.2.3实验方法参照《现代实验动物学技术》依次行引物设计、卵泡MiRNA提取、颗粒细胞分离和体外培养、颗粒细胞转染MiRNA、颗粒细胞凋亡和增殖水平检测等，（1）引物设计（由大连宝生物技术有限公司设计合成）；（2）卵泡MiRNA提取：首先行样品处理，然后采用PBS缓冲液行裂解处理，将已反转录好的模板行RT-PCR反应，反应程序：95℃条件下预变性（时间为5min）、95℃条件下变性（时间为10s），60℃条件下退火（时间为30s），共进行40个循环后持续缓慢升温至95℃，自然冷却。结果分析：利用扩增倍数公式，重复三次计算样品中MiRNA-351表达量；（3）颗粒细胞分离和体外培养：使用胰酶、培养液等进行颗粒细胞分离、体外培养和传代；（4）颗粒细胞转染MiRNA：转染前应首先行接种处理，然后将细胞置于培养基孔中，摇匀后在培养箱中37℃条件下孵育，注意需要每隔4～6h更换一次培养基；（5）颗粒细胞凋亡和增殖水平检测：分别采用流式细胞仪和酶标仪对上述转染后的细胞进行凋亡和增殖水平检测，检测前需要将颗粒细胞进行PBS缓冲液冲洗