α―硫辛酸对EAE大鼠脊髓组织氧化应激状态影响.docVIP

α―硫辛酸对EAE大鼠脊髓组织氧化应激状态影响 　　摘要： 目的：研究α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，ALA）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响。方法：Wistar大鼠36只，按照随机数字表法分为正常对照组（CON组），EAE组、硫辛酸干预组（ALA组），每组各12只。采用kono评分观察各组大鼠的神经功能，采用分光光度法检测EAE大鼠脊髓组织中丙二醛（malondialdehyde， MDA）和还原性谷胱甘肽（glutathione， GSH）的含量，2，7-二氯荧光素二乙酸酯 （2， 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）探针检测脊髓组织中活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）的变化。结果：与CON组相比，EAE组大鼠神经功能明显下降，大鼠脊髓组织中MDA和ROS的含量明显升高，GSH含量明显下降（Plt;0.05）;与EAE组相比，α-硫辛酸治疗组大鼠神经功能明显改善，大鼠脊髓组织中MDA和ROS的含量明显下降，GSH含量明显升高（Plt;0.05）。结论：α-硫辛酸在EAE大鼠中可能通过减轻脊髓组织的氧化应激水平发挥其神经保护作用。 　　关键词：α-硫辛酸;多发性硬化;氧化应激 　　近来研究表明，氧化应激在多发性硬化（multiple sclerosis， MS）的发病中有重要的作用，抗氧化剂对MS有治疗作用[1]。α-硫辛酸（alpha-lipoic Acid，ALA）是一种天然强效抗氧化剂，主要的作用机制包括：清除螯合金属离子、自由基、活性氧，再生内源性抗氧化剂等，作为神经保护剂已被应用于神经系统多种疾病的防治。有研究者认为，ALA对氧化应激参与发病的慢性疾病具有治疗潜力[2]。实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型是研究人类MS疾病发病机制和筛选治疗药物的理想动物模型[3]。本研究观察ALA对EAE大鼠是否具有神经保护作用，及其对EAE大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物 清洁级健康雌性Wistar大鼠30只，7～8周龄，体质量200±20g;清洁级豚鼠3只，雌雄不限，体质量380±30g，购自河北医科大学实验动物中心。 　　1.2 主要试剂 α-硫辛酸购于美国Sigma公司，佐剂用卡介苗购于北京生物制品研究所，MDA试剂盒、GSH试剂盒和DCFH-DA均由碧云天生物技术有限公司提供。 　　1.3 动物模型的建立 3只健康豚鼠常规水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速取脊髓全长，并制备豚鼠脊髓匀浆，其比例为脊髓重量与冰盐水体积为1：10。制备好的豚鼠脊髓匀浆与匀浆含6mg/mL卡介苗的等体积的完全福氏佐剂混合，冰上抽打制成完全免疫抗原。分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射制备好的完全免疫抗原（总剂量为0.5mL/只），从而建立EAE大鼠模型。 　　1.4 实验分组 将Wistar大鼠随机分组，采用随机数字表法，共分为3组，正常对照组（CON组），EAE组和α-硫辛酸治疗组（ALA组），各组均为10只大鼠。ALA组自第一次发病起给予药物（100mg?kg-1?d-1）腹腔注射，连续注射30天。正常对照组和EAE组每日给予0.9%无菌生理盐水腹腔注射，连续注射30天。 　　1.5 神经功能评分 采用国际通用的Kono评分：1分，动物尾部无力;2分，尾部无力，伴有双前肢或双后肢无力;3分，双前肢或双后肢瘫痪;4分，四肢瘫痪，被动翻身后不能复原;5分濒死状态或死亡。 　　1.6 ROS检测 在发病第31天取材，大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，于冰上迅速分离并留取大鼠的脊髓组织。再用眼科剪将脊髓组织剪成碎块，并制备单细胞悬液。单细胞悬液离心弃上清后，加入DCFH-DA工作液，并于37°C避光孵育30min。利用FACS Aria II流式细胞仪进行检测，每个样本收集1万个细胞。脊髓组织中ROS的含量以DCF的荧光强度来代表。 　　1.7 MDA及GSH检测 各组动物均在发病第31天取材，大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，，冰盘上取脊髓，液氮速冻后-80°C保存，用于检测MDA和GSH含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。 　　1.8 统计学处理 各项数值均用X±s表示。利用SPSS13.0软件对数据进行统计分析，多组间均数的比较选用单因素方差分析，两组间均数比较选用LSD检验。Plt;0.05作为差异有统计学意义的标准。 　　2 结果 　　2.1大鼠神经功能评分 自免疫开始每天对大鼠的神经功能进行评分，共记录30天。对各组大鼠