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ELISPOT技术应用 　　[关键词]酶联免疫斑点检测技术；应用 　　[中图分类号]R932-33[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）10（c）-007-02 　　 　　酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)是一项非常先进的免疫学检测技术。结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（ELISA）的长处，能够分析经特异抗原活化后分泌细胞因子(如IFN-γ、TNF-α等)的单个效应细胞的频数，具有敏感、特异、易于重复的优点。这些独特优点让ELISPOT成为国际公认的检测抗原反应性效应细胞的最可靠的实验方法之一[1]，它目前已经成为抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。 　　 　　1 ELISPOT技术的发展历史 　　 　　ELISPOT形成今天的形势，历史上有几个关键的里程碑：①1983年，ELISPOT作为一种新的技术得到报道[2,3]；②检测IFN-γ分泌细胞的ELISPOT技术在1988年得到报道；③第一次在96孔板用硝酸纤维素膜和随后的PVDF板；④1997年，第一台全自动化的ELISPOT读板机面世[4]；⑤ELISPOT技术的应用得到报道，这种技术被认为是细胞免疫发展的一项关键性技术。目前，ELISPOT的技术得到了不断的发展，应用前景广阔。 　　 　　2 ELISPOT的基本原理 　　 　　此技术操作在96孔培养板上进行，直接以培养板的PVDF膜等为基质，包被上特异性单克隆抗体，之后，在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下，T细胞就开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方膜上的单克隆抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，可以在膜的局部形成一个个圆形斑点[5]。 　　 　　3 ELISPOT 技术的优点 　　 　　ELISPOT之所以得到广泛的应用，主要是由于它在检测抗原特异性细胞低频数时的高敏感性，比以流式细胞术为基础的技术（四聚体和细胞内细胞因子染色）的敏感性要高出1~2个数量级。另外ELISPOT是少数的几个可以利用冻存的PBMCs(外周血单个核细胞)来进行免疫监测分析的技术，而不丧失细胞的重要活性[6]，并且随着计算机辅助图像分析系统的使用，使大规模研究成为可能，这些对临床做回顾性或前瞻性研究都是很关键的因素。 　　 　　4 ELISPOT技术标准化与验证 　　 　　由于ELISPOT检测的超高灵敏度，它的斑点形成容易受到诸多因素的影响。如果不采取措施，检测的重复性很难保证，这就要求对ELISPOT进行标准化和验证[7]。 　　4.1 ELISPOT技术的标准化 　　4.1.1 ELISPOT板首选96孔培养板。包被硝酸纤维素膜的培养板包被能力不一，常常导致培养孔周围形成小而弱的斑点。后来出现了PVDF膜，Weiss AJ[8]研究发现，这两种膜都有很高的蛋白结合能力，特别是PVDF板，可以获得更多，轮廓更清晰的斑点。随着ELISPOT IP和HP以及HTS板材的应用，质量得到了进一步的提升，包括优化的膜表面能阻止细胞向孔周边聚集以及防漏功能。曾有人应用塑料ELISA板，显示出更好的经济效益，但是因为其蛋白结合能力有限而不建议使用。一项研究中尽可能使用同一种板材，最好是同一批次。在已经验证了的操作规程中把硝酸纤维素板改成PVDF板就可能导致不理想的结果。同时还要检查生产厂家的质量控制程序，批次性能和是否达到生物分子筛查协会SBS制定的标准。 　　4.1.2 包被规程使用PVDF，建议预湿时每孔加入15 μl的70％酒精来克服膜的疏水性。避免过长的孵育时间，因酒精的挥发会导致膜的高疏水性。酒精必须有效地被洗掉，残留的酒精会干扰斑点的形成。抗体的选择根据实验要求而定，还需考虑抗体敏感性等。商品试剂盒在检测同一个细胞因子的敏感性时可以相差10倍，所以需要进行标准化和验证。标准化中的一个重要参数是包被抗体总量，一般认为每孔约0.5~1.0 μg包被抗体可以得到理想的斑点。 　　4.1.3 细胞准备①细胞分离：由于红细胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影响T细胞功能，所以PBMCs的分离是必需的。如果经过处理和分离后红细胞在细胞沉淀中仍可看到，可以用低渗溶液溶解这些杂质红细胞。②冻存、贮藏和运输：冻存在细胞处理过程中最关键。冻存包括在约1° C/min的速度下冷冻细胞，同时加入细胞保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)。细胞的冻存有几种方法，自动控制降温机可以提供逐步智能降温，这在细胞最佳冻存及其标准化程序中是必需的。比较经济实用的方法就是使用装有异丙醇的冻存盒。血液样本处理，分离及冻存的最佳时间范围应该在8 h