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分子生物学实验中常见的问题与对策 8 分类：分子生物学技术 Ⅰ各种PCR技术常见问题与解决方案 1假阴性，不出现扩增条带或带很弱。 ⑴可能是因为模板有问题，如DNA不纯，含有杂蛋白，含有Taq酶抑制剂；或DNA量太少，超出实验的灵敏范围；或在提取模板时吸入酚；或DNA已严重降解，需要扩增的特意位点已丢失；或模板核酸变性不彻底。解决方案：采用纯化方法除去抑制物，提取DNA的过程中避免交叉污染，尽可能保持大分子量DNA，配制有效而稳定的消化处理液，程序应固定不宜随便更改。 ⑵可能是因为酶有问题，如酶活性低或失活。解决方案：检查所用Taq酶是否过期，更换新酶，按照推荐的量加入Taq酶，确保从酶加入到反应开始时间尽可能量短。 ⑶可能是引物有问题，引物浓度太低或引物降解。解决方案：选择正确的引物浓度，引物合成后的稀释需用无核酸酶的无离子水，否则引物会降解，在从储存液中吸取引物前一定小心混匀，按照推荐的量加入引物。 ⑶可能是扩增程序错误。解决方案：选用每个位点的正确程序。 ⑷可能是DNA样品中盐浓度过高或者体系的PH值发生改变，反应缓冲液中的K+，Na+，或Mg2+过高，均不利于反应。解决方案：所加入模板DNA的体积不应超过整个反应体系的1/5。 ⑸反应管与扩增仪加热模板块间结合不紧密，或者扩增仪温度控制系统存在问题。解决方案：调校扩增仪，选用标准反应管。反应管必须是经过硅化处理的。 ⑹可能