不同提取方法对槐耳提取物粗多糖含量及K562细胞抑制作用影响お.docVIP

不同提取方法对槐耳提取物的粗多糖含量及K562细胞抑制作用的影响お 　　采用普通水提法、高温高压水提法、冷碱法、热碱法对槐耳（Trametes robiniophila）子实体进行提取，考察了水溶性提取物中粗多糖含量、粗多糖实际得率和对K562细胞的抑制率。碱提法水溶性提取物的得率高于水提法，其中热碱法提取物的得率最高为29.65%，但其粗多糖含量最低，冷碱法粗多糖的实际得率最高为6.93%。四种提取物对K562细胞均有抑制作用，热碱法提取物浓度为2 mg/mL作用于K562细胞72 h后，抑制率高达92.28%。 　　槐耳； 提取物； 提取方法； 粗多糖； K562； 抑制率 　　槐耳（Trametes robiniophila）是我国民间重要的药用真菌，中药名为槐栓菌[1]，生长在槐及洋槐、青檀等树干上，具有“治风”、“破血”、“益力”的功效，民间多用于治疗癌症和炎症，抗癌新药金克槐耳颗粒已广泛地用于各种恶性肿瘤的治疗，其主要活性成分为多糖蛋白[2]。真菌多糖的提取方法有水提法、酸提法、碱提法、盐析法、酶法、超声波法、超临界流体提取法等[37]，而对于槐耳的研究，近年来主要集中在槐耳颗粒或浸膏对肿瘤细胞抗性方面[810]，鲜见槐耳提取方法的研究。因此笔者采用普通水提法、高温高压水提法、冷碱法、热碱法对槐耳子实体进行提取，比较水溶性提取物的粗多糖含量、粗多糖实际得率和其对K562细胞的抑制率，为槐耳产品的生产提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1供试材料与细胞株 　　槐耳人工栽培子实体由青岛农业大学应用真菌省级重点实验室提供（菌株为T191，培养料配方：国槐木粉89%，麦麸10%，石膏1%）。K562白血病细胞株由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。 　　1.2试剂 　　RPMI1640培养基、胎牛血清为Thermo Fisher公司产品；二甲基亚砜（dimethylsulfoxide， DMSO）为Sigma公司产品；其它试剂为国产分析纯。 　　1.3提取方法 　　槐耳子实体掰成小块风干至恒重后，用粉碎机粉碎，过100目筛，分别用不同方法提取。每种方法取25 g子实体干粉，进行脱脂预处理，即以CHCl3∶MeOH∶H2O=10∶10∶3的比例分别加入三氯甲烷200 mL、甲醇200 mL、蒸馏水60 mL，搅拌均匀后于25 ℃下静置2 d，抽滤去上清后烘至恒重[11]。 　　1.3.1普通水提法 　　向脱脂并烘干的样品中加入蒸馏水500 mL，置90 ℃水浴恒温浸提2 h，重复一次，7870 g离心20 min，合并2次上清液，减压浓缩至250 mL，加入4倍体积预冷的无水乙醇[7]，4 ℃沉淀24 h后，2490 g离心15 min，将沉淀物冷冻干燥。 　　1.3.2高温高压水提法 　　向脱脂并烘干的样品中加入蒸馏水500 mL，置高压灭菌锅中，121 ℃，浸提2 h，重复一次，其余步骤同1.3.1。 　　1.3.3热碱法 　　向脱脂并烘干的样品中加入500 mL蒸馏水，50 g NaOH，25 g尿素，搅匀后置65 ℃水浴恒温浸提1 h，7870 g离心20 min，用HCl调pH至中性，减压浓缩至250 mL，按1.3.1的方法用乙醇沉淀后将沉淀物冷冻干燥之后重新溶于水中，7870 g离心20 min，取上清液，再按上述方法醇沉，将沉淀物冷冻干燥即得热碱提水溶性粗多糖。 　　1.3.4冷碱法 　　向脱脂并烘干的样品中加入500 mL蒸馏水，50 g NaOH，25 g尿素，搅匀后置4 ℃冰箱中浸提48 h，其余步骤同1.3.3。 　　1.4粗多糖含量测定 　　参考《中华人民共和国农业行业标准NY/用菌中粗多糖含量的测定》测定不同提取方法得到的提取物中的粗多糖含量[12]，并计算粗多糖得率。 　　1.5不同提取物对K562细胞的抑制率测定 　　将4种提取方法得到的提取物分别以RMPI1640培养液溶解，配成2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL的溶液。K562细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640中培养，培养条件为37 ℃，5%CO2。每3～4 d进行一次传代。取对数生长期的细胞，用RPMI1640培养液稀释至1×106个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，然后分别加入不同浓度的槐耳提取物100 μL，作用终浓度为1，1.5和2 mg/mL，每种浓度设5个重复。以RPMI1640培养液和细胞为阴性对照，空白对照组为RPMI1640和相应浓度提取物（以消除提取物自身颜色对吸光度的影响）。孵育72 h后置用倒置显微镜观察其形态，加20 μL 5 mg/mL的MTT，4 h后离心（3000 g，15 min）去上清，每孔加入150