一种新型解脲脲原体核酸检测试剂盒临床应用初步评价.docVIP

一种新型解脲脲原体核酸检测试剂盒的临床应用初步评价 　　摘要：目的通过对比实验，对新型解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，UU）核酸检测试剂（采用一步法处理样本，以下简称一步法）的临床使用进行评价。方法用一步法试剂与煮沸法试剂对176例临床收集的样本进行UU DNA检测并对比其结果，同时，将两种试剂的检测结果分别与培养法结果进行对比。结果新型解脲脲原体核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比为99.00%，阴性一致性百分比为96.05%，总一致性百分比为97.73%；对4例不符样本进行测序复核，并对复核后的结果进行Kappa检验一致性分析，结果Kappa值=1.000，表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性。在与金标准培养法检测结果的对比中，两种试剂均表现出较好的准确性。结论新型解脲脲原体核酸检测试剂与已上市煮沸法试剂的检测结果阴阳性一致性较好，操作简单快速，减少污染环节，并具有内标控制假阴性，灵敏度更高，结果准确，符合临床检测要求，具有较高的临床应用价值。 　　关键词：解脲脲原体；UU DNA；荧光定量PCR；一步法；煮沸法解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，UU）是一类原核细胞微生物，体积介于细菌与病毒之间，是引起泌尿生殖道感染的常见病原体[1]。UU感染不仅引起非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU），也可引起多种泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睾炎等，还被认为是引起女性原因不明的不孕、流产以及死胎等的原因之一。由于UU感染临床表现无特异性，常易漏诊，因此，快速、灵敏、特异的诊断方法是预防UU感染的关键[2]。目前解脲脲原体的实验室诊断方法主要有分离培养法、免疫学方法、基于核酸检测的分子生物方法等。分离培养法的特异性和敏感性高，但其具有临床检测时间过长（至少需要24~48 h，甚至更长时间），过程繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响等缺陷，不适用于大范围检测。免疫学法具有快速、简便、灵敏度高等优势，但受多种因素的影响，目前国内也没有商品化的试剂盒（仅有一个蛋白芯片检测系统获得批准认证）。近年来，聚合酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反映患者治疗前、后病原体变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染[3]。但目前国内同类试剂一般采用煮沸法提取核酸，费时费力，在操作过程中容易导致污染，而且大部分试剂没有预防假阴性的内标控制和抗污染系统，影响检测结果的重复性和稳定性。最近，新出现了一种一步法UU 核酸检测试剂，它完全免去了核酸提取过程。根据其说明，UU核酸经常温裂解后全部释放参与到PCR反应中，整个过程无污染、操作极其简单、迅速。本研究拟通过检测临床样本，将其与市场上的煮沸试剂进行比对，来评估这一新方法的准确性及特异性。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 本次研究共检测生殖道分泌物样本176例，其中男性病例87例（49.4%），女性病例89（50.6%），-20℃冰箱保存。 　　1.2主要试剂和仪器 新型UU核酸检测试剂购自湖南圣湘生物科技有限公司，采用一步法技术处理样本（以下简称新型试剂或一步法试剂），具有内标监控假阴性，最低检测限为400 copies/mL；同时，选择一种临床使用客户较多的国产UU核酸检测试剂，采用煮沸法提取样本核酸，没有内标监控，作为对照试剂，最低检测限为500 copies/mL。核酸扩增仪采用美国Stratagene公司的Mx3000P实时荧光定量PCR仪。 　　1.3方法 分别采用两种荧光定量PCR检测试剂对176例临床样本（每例样本一分为三，保留一份样本作为复检）进行检测，方法如下。 　　1.3.1煮沸法 取200 μL临床样本，12000 rpm离心5 min，去上清；向沉淀中加灭菌生理盐水500 μL混匀，12000 rpm离心5 min，去上清；向沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10 min，12000 rpm离心5 min备用；取2 μL作为PCR反应的模板，加入分装有PCR反应液的反应管中上机检测。 　　1.3.2一步法 PCR反应管中加入5 μL核酸释放剂，加入5 μL标准品、待检样本，吸打混匀，加入40 μL PCR反应液，吸打混匀上机检测即可。 　　1.4统计学分析 数据进行阴阳性一致性分析，灵敏度、特异度分析和kappa检验一致性分析。 　　2结果 　　2.1扩增曲线对比，见图1~3。 　　2.2根据煮沸法试剂检测结果将临床样本分为