三叶木通组织培养和多倍体诱导.docVIP

三叶木通的组织培养和多倍体诱导 　　摘要：以三叶木通种子为外植体诱导产生丛生芽，再用不同浓度的秋水仙素溶液对丛生芽进行不同时间的诱导，并用染色体计数法检测材料倍性。结果表明，丛生芽诱导的较好方式为消毒好的种子沿其背腹线纵切成半后接种于MS+1.0 mg/L 6-BA的培养基中诱导出无菌苗，然后将无菌苗接种于MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的继代增殖培养基中培养。0.3%的秋水仙素处理24 h效果最好，多倍体诱导率达12%。 　　关键词：三叶木通；组织培养；丛生芽；多倍体 　　中图分类号： S567.904文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0069-03 　　三叶木通[Akebia trifoliate （Thunb.） Koidz.]为木通科木通属藤本植物，全株均可入药，具有通经下乳、清热利尿等功效，主要分布于甘肃、贵州、河北、河南、山东等地[1]。三叶木通果实具有发达的胎座组织，味甜可口，具有独特的风味，含有许多人体必需营养成分[2-3]，是一种具有开发潜力的保健水果，但存在果皮厚、种子多、可食率低的问题。多倍体植株具有生物产量增加、药用活性成分增加、抗逆性增强、植株育性下降、少籽或无籽等特点，多倍体育种可成为三叶木通遗传改良的途径之一。植物离体诱导多倍体的方法已成功地在许多植物中取得成功，其中建立组培快繁体系是其必要环节。本试验旨在以三叶木通幼嫩种子为外植体进行组织培养获得丛生芽，再用秋水仙素对丛生芽进行处理，以获得三叶木通多倍体材料，为无籽三叶木通的研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　三叶木通果实采自贵州省贵阳市花溪区棉花关，植株经贵州大学生命科学学院赵财副教授鉴定为木通科木通属植物三叶木通。 　　1.2方法 　　1.2.1外植体处理2014年8月中旬摘取三叶木通幼嫩果实，毛刷刷去表面尘土→洗洁精浸泡7 min→自来水冲洗20 min→超净工作台中取出种子→无菌水清洗种子数次→滤纸吸干表面水分→75%乙醇消毒15 s→0.1% HgCl2浸泡7 min→无菌水冲洗3次。将消毒好的种子横切成半、沿背腹线纵切成半，以不切作对照处理，然后分别接种到MS培养基（添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH值5.8～6.0，下同）中。每个处理接种20个培养瓶，每瓶4粒种子。（25±2） ℃黑暗培养40 d，统计出苗情况。 　　1.2.2无菌苗诱导培养采用合适的切种方式，将消毒好的种子接种在含6-BA不同浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）的MS培养基中进行无菌苗诱导，每个处理接种10个培养瓶，每瓶放5粒种子。（25±2） ℃黑暗培养30 d后，统计6-BA不同浓度处理下出苗率（出苗率=萌发外植体数/接种外植体数×100%）。 　　1.2.3继代增殖培养以MS培养基为基本培养基，设置不同激素组合的处理，共8种培养基（见表1中A1～A8号培养基）。将无菌苗接种于这些培养基中，每种培养基接种10瓶，每瓶3个外植体。（25±2） ℃光照培养（光照时间 12 h/d，光照度1 000 lx）45 d统计增殖系数。 　　表1继代增殖培养基 　　编号培养基A1MS+0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A2MS+0.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A3MS+1.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A4MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A5MS+2.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A6MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A7MS+3.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A8MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 　　1.2.4多倍体诱导将生长良好的幼嫩丛生芽接入抽滤灭菌的秋水仙素溶液中，摇床振荡培养。试验采用2因素3水平L9（32）正交试验试验设计，试验设计见表2。摇床转速设定为50 r/min，培养温度设定为24 ℃，光照24 h/d，光照强度为1 000 lx。处理完毕后转接于MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的培养基中培养。培养条件同上。 　　1.2.5多倍体鉴定取出小丛生芽块，放入卡诺氏固定液（无水乙醇 ∶冰乙酸体积比 3 ∶1）中，0 ℃固定1周后，将小丛生芽块取出放到载破片上，用镊子捣碎小丛生芽块，用改良 　　`宝品红染色液染色1～2 min，盖上盖破片后在光学显微镜下观察，拍照。根据染色体数确定加倍处理材料的倍性。 　　2结果与分析 　　2.1切种方式对种子出苗的影响 　　从表3可知，沿背腹线纵切成半的种子出苗率最高（325%），横切