三氧化二砷结肠癌SW480细胞凋亡及pololike kinase1基因表达影响.docVIP

三氧化二砷结肠癌SW-480细胞凋亡及polo-like kinase-1基因表达的影响 　　摘要：目的 观察三氧化二砷对人结肠癌细胞SW-480并探讨其作用机理。方法采用不同浓度的三氧化二砷作用结肠癌SW-4g0细胞后，采用MTT法检测细胞的恶性增殖，采用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡及细胞周期情况，采用定量PCR检测polo-like klnase-1 (PLKl) mRNA水平。结果三氧化二砷能抑制结肠癌细胞的恶性增殖，且与浓度相关。三氧化二砷能诱导结肠癌细胞凋亡，且呈浓度依赖性。流式细胞仪检测发现，三氧化二砷将细胞阻滞在G2／M期。三氧化二砷能下调结肠癌PLKl mRNA水平，且呈药物浓度和作用时间依赖性。结论 三氧化二砷有效地抑制结肠癌SW-480细胞增殖，其机制可能与其下调PLKl表达，从而诱导凋亡有关。 　　关键词：三氧化二砷；结肠肿瘤；Polo样酶；凋亡；细胞周期 　　蛋白酶Polo家族是一组重要的细胞周期调控因子。PLKl是哺乳类该基因家族成员之一。在低等动物中，该家族成员能控制中心小体功能，染色体分离和胞浆移动[1]。有研究发现，PLKl在80％以上的肿瘤组织或细胞中表达增高，而正常组织无表达表达极弱[2，3]。提示PLKl是肿瘤治疗的一个重要靶点。 　　近年来发现 As203在临床上具有良好的治疗急性早幼粒白血病(APL)的效果，其机制主要是通过诱导细胞凋亡[4]。但该药在胃肠道肿瘤中应用较少。为此，我们采用三氧化二砷处理结肠癌SW-480细胞，并检测细胞凋亡及PIKl基因的变化。旨在探讨三氧化二砷对结肠癌细胞的抑制作用及可能的分子机制。 　　 　　材料与方法 　　 　　1材料 As203购自Sigma公司，用生理盐水配成1 mmol／L的贮存液，使用前用含有10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基稀释到所需浓度。结肠癌细胞株SW-480，购自中国科学院上海细胞所，在37℃，5％CO2培养箱中培养，培养液为含10％小牛血清、100U／ml青霉素和100 ug／ml链霉素的RPMI―1640(美国GIDCO BRL)。 　　2细胞增殖抑制检测 待结肠癌细胞生长至指数生长期，收取细胞，调整细胞浓度为1x104／ml，按每孔0．2ml接种到96孔培养板中，设空白对照组和不同浓度的实验组，设3复孔。采用四唑蓝(MTT)比色法检测结肠癌细胞的恶性增殖。 　　 　　3结肠癌SW-480细胞凋亡检测 　　3．1琼脂糖凝胶电泳 细胞至对数生长期，放置4℃1h，使细胞生长同步化。用不同浓度的三氧化二砷作用3h后移去药液，换液继续培养，倒置显微镜下观察。收集细胞，用饱和酚氯仿法抽提DNA，无水乙醇沉淀。25℃琼脂糖凝胶电泳，电压60V，1．5 h。 　　3．2细胞周期检测　收集经过不同浓度处理的结肠癌细胞，PBS洗涤后，用4℃乙醇固定24h，离心除去乙醇，加入1％RNA酶溶液200ul，37℃水浴15min，加入碘化亚啶，于FACScan流式细胞仪检测。 　　4 PLKl基因mRNA水平检测 　　采用实时定量PCR检测。应用TRIz01抽提细胞总RNA， 取总RNAlug，以oligo dT为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2uL为模板进行PCR扩增，步骤参照说明书。引物序列为：上游：5-CAAGCTCATCTTGTGCCCACT -3’； 下游：5’-GAGAAAGGGCTGCCAGGC-3’。FAM探针：5-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3’-TAMRA。以GAPDH为内参。PCR反应条件为：95℃，预变性3min，95℃，30s；52℃，45s；72℃，45s；35个循环后再72C延伸7min。 　　5统计方法　采用SPSS 10．0统计软件进行F检验和t检验。 　　 　　结果 　　1蟾蜍灵对结肠癌细胞增殖的抑制作用　从图l可见。蟾蜍灵对结肠癌细胞有明显的抑制作用。随着浓度的增加，对结肠癌SW-480细胞的抑制作用也明显增强。 　　2三氧化二砷诱导结肠癌细胞凋亡 　　图1所示，不同浓度的三氧化二砷处理SW-480细胞48h后，基因组DNA凝胶电泳显现明显的梯状图谱。0．5umol／L时即可呈现微弱的梯状电泳带，随着浓度的增加，条带变得更为清晰。 　　3三氧化二砷结肠癌对细胞周期的影响 　　为详细地了解三氧化二砷对结肠癌细胞凋亡的影响，我们采用流式细胞术检测亚-2N DNA含量(凋亡细胞)以分析PIKl表达水平是否与凋亡有关系。结肠癌细胞处理组sub-2N DNA 含量明显高于对照组。接着，我们分析了对结肠癌细胞周期的影响。如图所示，与对照组比较，处理组G2／M 期明显阻滞。 (见表1)。 　　 　　4 PLKl基因mRNA表达