中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶免疫调节作用初步研究.docVIP

中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶免疫调节作用的初步研究 　　【摘 要】目的：分析中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶的免疫调节作用。方法：利用LPS和TNF-α 作为免疫激活因子，刺激中华绒螯蟹的免疫系统，然后检测被激活的免疫系统对中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶的表达水平和酶活力的影响。结果：LPS和TNF-α 可显著提高中华绒螯蟹血淋巴细胞中AChE基因的表达水平和血淋巴上清液中ACh的浓度。结论：中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶在其免疫应答反应过程中发挥着重要的作用。 　　【关键词】中华绒螯蟹；乙酰胆碱酯酶；LPS；TNF-α 　　【中图分类号】R412 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）04-0-01 　　乙酰胆碱酯酶（AChE； EC 3.1.1.7）能催化分解乙酰胆碱，是胆碱能神经系统的重要组成部分。在脊椎动物中，乙酰胆碱酯酶可以通过控制血清中乙酰胆碱的浓度，来调节炎症反应[1]，而关于乙酰胆碱酯酶在无脊椎动物中的免疫调节研究相对较少。目前，已有研究表明乙酰胆碱酯酶广泛存在于无脊椎动物胆碱能神经系统中，且在扇贝等软体动物中发挥着重要的免疫调节作用[2]。本研究拟利用LPS和TNF-α 刺激中华绒螯蟹，检测中华绒螯蟹血淋巴中乙酰胆碱酯酶基因的时序表达变化规律及血淋巴中乙酰胆碱浓度的时序变化，本研究可进一步丰富无脊椎动物胆碱能神经免疫的内容。 　　1 仪器和试剂 　　高压灭菌锅（上海申安）、超低温冰箱（中科美菱）、高速冷冻离心机（艾本德）、温度梯度PCR仪（艾本德）、实时荧光定量PCR仪（罗氏LC96）、酶标仪（伯腾）、脂多糖LPS（Sigma，0.5 mg/mL）、肿瘤坏死因子-α（Sigma，乙酰胆碱检测试剂盒（Abnova）、RNA提取试剂盒（Invitrogen）、dNTP（Promega）、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（??生物）等。 　　2 实验方法 　　2.1 LPS免疫刺激实验 于五月份准备280重量平均为 50 ± 5 g 的中华绒螯蟹，随机选取120只作为 LPS 刺激组，另取 120 只作为对照组，剩余 40 只作为空白组，分别作如下处理： 　　LPS 刺激组：每只注射 50 μL LPS（0.5 mg/ml，in PBS） 　　对照组：每只注射灭菌 50 μL PBS 　　空白组：不做任何处理 　　注射后的 LPS 刺激组和对照组中的中华绒螯蟹立即放回养殖桶，同时随机取样 15 只空白组中的中华绒螯蟹。在注射后 3、6、12、24、48 和 96 小时，分别在 LPS 刺激组和对照组中随机取样15只中华绒螯蟹。从取样的中华绒螯蟹中抽取血淋巴，并将三只中华绒螯蟹的血淋巴混在一起，作为一份样品。800 g 4 °C 离心血淋巴 10 min，留血淋巴细胞用于提取总 RNA，留血淋巴上清液用于检测乙酰胆碱浓度变化。 　　2.2 TNF-α免疫刺激实验 2.10栉孔扇贝的 TNF-α 刺激实验。于五月份准备 280 只平均重量为 50 ± 5 g 的中华绒螯蟹，随机选取120只作为 TNF-α 刺激组，另取 120 只作为对照组，剩余 40 只作为空白组，分别作如下处理： 　　TNF-α 刺激组：每只注射 50 μL TNF-α（50 ng/mL，in PBS） 　　对照组：每只注射灭菌 50 μL PBS 　　空白组：不做任何处理 　　注射后的 TNF-α 刺激组和对照组中的中华绒螯蟹立即放回养殖桶，同时随机取样 15 只空白组中的中华绒螯蟹。在注射后 3、6、12、24、48 和 96 小时，分别在TNF-α 刺激组和对照组中随机取样15只中华绒螯蟹。从取样的中华绒螯蟹中抽取血淋巴，并将三只中华绒螯蟹的血淋巴混在一起，作为一份样品。800 g 4 °C 离心血淋巴 10 min，留血淋巴细胞用于提取总 RNA，留血淋巴上清液用于检测乙酰胆碱浓度变化。 　　2.3 中华绒螯蟹血淋巴中 ACh 的浓度测定 ACh 测定采用 Abnova 公司生产的 ACh 试剂盒（KA1624）。乙酰胆碱可以 被乙酰胆碱酯酶催化为胆碱和乙酸，胆碱在胆碱氧化酶的催化下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢能与一种特殊的染料形成粉红色产物。这种粉红色产物在 570 nm 下的光密度值，跟乙酰胆碱的浓度成正比。 　　2.4 中华绒螯蟹总 RNA 的提取 无菌条件下采集中华绒螯蟹血淋巴样品，于 800 g 4 °C离心 10 min 后收集血淋巴细胞，加入 1 mL RNAiso plus，迅速用 5 mL 注射器快速吸打破坏血淋巴细胞；然后每 1 mL RNAiso plus 加入 0.2 mL 预冷氯仿，用力振荡 2 min，12，000 g 4℃离心 15 min；离心后，混合物分为上层 RNA