肉及肉制品中猪牛羊马驴鸡鸭鹅兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法行业标准.docVIP

ICS FORMTEXT 点击此处添加ICS号 FORMTEXT FORMTEXT FORMTEXT SB 中华人民共和国 FORMTEXT 国内贸易行业标准 FORMTEXT SB/T FORMTEXT XXXXX— FORMTEXT 2012 FORMTEXT FORMTEXT 肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法 FORMTEXT Species identification of porcine, bovine, sheep, horse, donkey, chicken, duck, goose and rabbit derived materials in meat and meat products RT-PCR method FORMTEXT 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 FORMDROPDOWN FORMTEXT FORMTEXT - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中华人民共和国商务部发布 SB/T XXXXX—2012 PAGE \* MERGEFORMAT 6 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。 本标准起草单位： 本标准主要起草人： 肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法 范围 本标准规定了运用实时PCR技术对肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定方法。 本标准适用于肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速定量鉴定。 本标准中所建立的检测方法对猪、牛、羊、马、兔源性成分DNA的检测下限为0.001 ng/μL，对驴、鸡、鸭、鹅的检测下限为0.01 ng/μL。 注：本标准中“肉及肉制品”主要指新鲜肌肉组织或经过初步加工的生肉制品。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 HYPERLINK /standard/sort/3/16437.html \t _blank GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 1193 基因检测实验室技术要求 GB/T 21103-2007 动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法 术语、定义和缩略语 实时荧光 PCR real time PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 Ct值 cycle time 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 原理 采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的细胞色素氧化酶b（cytochrome oxidase subunit b，cytb）基因上畜禽各物种间序列差异而进行动物源性成分鉴定。以Genbank上公布的猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔的cytb基因序列，设计合成检测各自的特异性引物对；利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板，使用各物种的特异性引物进行实时荧光PCR扩增，并通过标记报告基因6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein, FAM）、淬灭基因6-羧基四甲基若丹明（6 - carboxyl tetramethyl rhodamine, TAMRA）的探针进行特异性杂交。观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对肉及肉制品中的动物源性成分进行快速测定。 试剂和材料 试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T 27403-2008和SN/T 1193的规定执行。 除另有规定外，试剂应为分析纯或化学纯级别，实验用水应符合GB/T 6682的要求。 部分试剂的配制方法可参考附录A的介绍。 猪源性成分检测用引物（对）序列为： FP（正向引物）：5′- CGACAAAGCAACCCTCACAC-3′ RP（反向引物）：5′- TGCGAGGGCGGTAATGAT-3′ Pro（探针）：5′ FAM- CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-TAMRA 3′ 牛源性成分检测用引物（对）序列为： FP：5′- CTCCTCGGAGACCCAGATAAC -3′ RP：5′- AGAAGTATCACTCGGGTTTG -3′ Pro：5′ FAM- CCAGCCAA