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看最新文献如何打造“高完”基因组 参考基因组是一个物种系统研究的起点，自2003年人类基因组计划完成之后，测序技术迅猛发展，测序读长不断加长、通量不断提升、时间不断缩短、成本不断下降，越来越多的物种基因组序列被破译，高重复、高杂合、超大基因组组装也都不再困难，相信在不久的将来，每个物种都会有自己的参考基因组。 图1 部分具有参考基因组的物种 随着测序读长的提升（以Pacbio和Nanopore为主），算法变得越来越简单，三代测序数据可直接通过overlap进行拼接，无需构建复杂的De Bruijn图，即可获得质量更高的基因组图谱。 上个月，中科院梁承志研究组开发了显著提升Contig N50的组装方法HERA[1]，并在水稻、玉米、人和苦荞基因组中进行了测试，与已发表版本进行对比，玉米的Contig N50从1.3 Mb提升至61.2 Mb，人的Contig N50从8.3 MB提升至54.4 MB，水稻的Contig N50从1.3 Mb提升至14.4 Mb，苦荞基因组Contig N50达到了27.85 Mb。HELA作为一种新的基因组组装方法，不仅可以提升Contig指标，还能填补混合组装基因组图谱或Scaffold中的gap，填补和纠正遗传图谱或Hi-C数据组装的染色体中的gap和错误。 图2 水稻、玉米、人和苦荞基因组组装结果对比 近日，农科院阮珏研究组开发了提升三代测序Contig N50的组装方法LRScaf[2]，不仅可以组装高连续性的Contig，还能缩短运行时间，已利用Pacbio和ONT数据在大肠杆菌、酿酒酵母、果蝇、水稻和智人基因组中进行了测试。 5个物种Pacbio测序深度及平均读长分别为：大肠杆菌（20.1X，8.7 Kb）、酿酒酵母（20.7X，4.6 Kb）、果蝇（18.9X，19.6 Kb）、水稻（11.7X，3.4 Kb）和智人（20.0X，1.6 Kb），进一步利用不同方法进行组装。通过 SSPACE-LongRead、SMIS、Unicycler和LRScaf将大肠杆菌基因组组装成一条完整的序列，而LINKS、OPERA-LG、npScarf和DBG2OLC则未能实现；果蝇中，SSPACE-LongRead组装出的NG50最长（6.6 Mb），而LRScaf（BLASR）组装出的NA50最长（5.2 Mb）；智人中，LRScaf（minimap2）组装出的NG50（10.4 Mb）和NA50（10.7 Mb）均最长。 图3 不同软件对5个物种Pacbio数据组装结果比较 3个物种ONT测序深度及平均读长分别为：大肠杆菌FULL（4.7X，5.7 Kb）、大肠杆菌ALL（34.0X，6.1 Kb）、大肠杆菌RAW（66.5X，3.6 Kb）、酿酒酵母-NANOCORR（43.6X，5.5 Kb）、酿酒酵母-RAW（ 198.2X，5.1 Kb）和智人（35.0X，4.6 Kb），进一步利用不同方法进行组装。大肠杆菌FULL中，LRScaf（BLASR）组装出的NG50（921.6 Kb）和NA50（485.2 Kb）均最长；智人中，LRScaf（minimap2）组装出的NG50（17.4 Mb）和NA50（13.6 Mb）也都最长。 图4 不同软件对3个物种ONT数据组装结果比较 软件运行时间对于生信分析来说至关重要，LRScaf是利用长读长数据进行分析耗时最短的软件，随着基因组的增大，这种优势变得更加明显。除此之外，减少组装错误也尤为重要，SMRT数据中，LRScaf组装的大肠杆菌、果蝇和水稻基因组错误最少；ONT数据中，LRScaf组装的大肠杆菌、酿酒酵母和智人基因组错误最少。由此可见，LRScaf是一款实用的软件，在缩短耗时的同时而不增加组装错误。 组装完成的基因组草图还需要进一步注释，包括重复序列预测、编码基因预测、假基因预测、非编码RNA注释和基因功能注释。近日，诺里奇科研公园Swarbreck David研究组开发了辅助基因组注释的Mikado[3]。Mikado是用python3和Cython编写的，由三个核心部分组成（prepare，serialise，pick），默认整合三种类型的数据：通过TransDecoder识别开放阅读框ORF，通过BLASTX或 Diamond得到蛋白相似度，通过Portcullis或者Stampy识别剪切融合事件。研究者将Mikado在秀丽隐杆线虫、果蝇、智人和拟南芥中进行验证，在模拟数据和真实数据中，精确度都得以提升（相比于平均水平）。总体来说，Mikado利用数据的内在互补性，对转录组件进行整合，产生高质量的转录本，辅助基因组注释。 图5 Mikado采用的算法 如今，基因组组装、注释都已不是难事，年初，德国马克斯普朗克分子细胞