人表皮干细胞分离培养.docVIP

人表皮干细胞的分离培养 　　【摘要】 目的 探索人表皮干细胞原代培养方法。方法 将皮肤标本进行分离， 用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后， 重悬细胞， 接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果 倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好， 表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P0.05）。结论 采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。 　　【关键词】 表皮干细胞；培养；鉴定 　　Isolation and culture methods of human epidermal stem cells Tian Ya-ning， Zhou Zhihui， Liang Man， et al. Second Affiliated Hospital of Shanxi University of traditional Chinese medi cine， Xian yang 712000， China 　　【Abstract】 Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ， the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted， epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes （P0.05）.Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells. 　　【Key words】 Epidermal stem cell； Culture； Identification 　　表皮干细胞具有无限增殖的能力， 在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。 　　1 材料与方法 　　1. 1 主要试剂 DMEM培养基（dulbeccos modified eagle medium， DMEM）， 单克隆抗体β1整合素， 单克隆抗体CK19， Ⅳ型胶原， DispaseⅡ酶， 胎牛血清（FBS）， 表皮细胞生长因子， 0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）。 　　1. 2 实验设备 CO2恒温培养箱， 无菌超净工作台， 倒置相差显微镜， 普通光学显微镜。 　　1. 3 方法 　　1. 3. 1 原代培养 严格无菌操作， 切取5×5 mm2左右的皮肤标本， 标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮， 切取前分离皮下组织， 将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次， 切成小皮块后置于含2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜， 培养基中含有青霉素（100 U/ml）及链霉素（100 μg/ml）， 第二天分离表皮和真皮层， 收集表皮皮片， 37℃条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15 min， 胎牛血清终止消化， 轻轻吹打， 200目筛网过滤， 收集细胞悬液， 1000 rpm离心5 min， 弃上清， 加入新鲜培养液（DMEM表皮干细胞完全培养液含10%的FBS， 10 μg/L 的表皮细胞生长因子， L-谷氨酰胺0.1 mM， 非必需氨基