基因沉默整合素连接酶对胰腺癌细胞上皮向间质转化的影响.docVIP

基因沉默整合素连接酶对胰腺癌细胞上皮向间质转化的影响 　　【摘要】 目的 探讨基因沉默整合素连接酶（ILK）对胰腺癌细胞（Panc-1）上皮向间质转化（EMT）的影响。方法 培养Panc-1细胞， 构建ILK-specific-shRNA慢病毒载体后， 再行转染Panc-1细胞， 通过Western-blot技术验证感染基因的有效性， 同时比较Panc-1细胞上皮向EMT转化标志性蛋白E-钙连蛋白（E-cadherin）表达情况。结果 ①基因沉默ILK明显的抑制了Panc-1细胞的迁移、侵袭能力， 且阳性组细胞迁移率和侵袭率均为（0.15±0.03）， 明显低于阴性组（0.43±0.02）， 差异具有统计学意义（t=23.572， P0.01）。②SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电脉法（SDS）结果：E-cadherin的条带为122～141 KD， GAPDH为37 KD的条带。siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达为（0.545±0.011）， 明显高于阴性组（0.079±0.004）， 差异有统计学意义（t=28.942， P0.01）。结论 基因沉默ILK转染后， 明显抑制Panc-1细胞迁移、侵袭能力， 显著上调E-cadherin 表达， 逆转了EMT 的发生。 　　【关键词】 基因沉默；整合素连接酶；胰腺癌细胞；上皮向间质转化 　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.194 　　胰腺癌发病率占常见恶性肿瘤的1%～2%， 死亡率高[1]。由于多数患者在确诊时己发生癌细胞转移， 无法进行胰腺切除手术， 只能采用化疗、放疗等姑息治疗手段， 随之产生的副作用严重降低了患者的生活质量。寻找新的治疗思路迫在眉睫。ILK是一种细胞内信号蛋白， 是多种致瘤相关因素的上游交叉点， 与肿瘤的形成、增殖、凋亡、转化和侵袭转移密切相关[2]。因此， 研究ILK对胰腺癌细胞EMT的影响可能是一种新的治疗思路。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 人胰腺癌Panc-1细胞株购自中国科学院细胞库；兔E-cadherin抗体、ILK多克隆抗体、BCA蛋白定量试剂盒、增强化学发光试剂、PVDF膜等购自武汉博士德生物工程有限公司；低温高速离心机购自德国Heraeus公司产品；转膜电泳槽购自美国 Bio-Rad 公司；PCR仪（PE2400）购自美国Perking Elmer公司。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 ILK-specific shRNA 慢病毒载体的构建 针对目的基因序列， 采用siSearch和sFold两种在线设计软件设计核苷酸序列[3]。将自行合成的含干扰序列的双链DNAoligo两端含酶切位点的粘端连入酶切后的RNA干扰载体上， 再转入制备好的细菌感受态细胞， 对长出的克隆先进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定， 测序比对， 鉴定阳性即构建成功。 　　1. 2. 2 感受态细胞的制备转染 人胰腺癌Panc-1细胞株常规接种于高糖杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）培养液中[4]（含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）， 于5%二氧化碳饱和湿度、37℃条件下培养， 每2天换液1次。将一个上述培养基中的单菌落转到SOB培养基中， 37℃剧烈振摇3 h， 然后转移到无菌预冷的丙烯管中， 冷却至0℃， 以4000 r/min离心10 min回收细胞。以0.1 mol/L CaCl2重悬， 4℃下， 4000 r/min离心10 min回收细胞， 连接反应制备克隆连接液， 转化。正常目的细胞在6孔板上分为三组：①空白组：未感染任何病毒；②阴性组：加阴性对照病毒感染；③阳性组：加RNAi靶点病毒感染。感染4 d后行PCR检测。 　　1. 2. 3 Western blot 检测 提取目的细胞中的蛋白， 蛋白定量法（BCA法）对蛋白进行定量测定。再取适量蛋白样品， 95℃加热变性， 以SDS分离， 每孔上样量为100 μg。常规处理后转至PVDF膜， 5%脱脂牛奶封闭40 min， 倒掉封闭液， 加一抗4℃孵育过夜， TBST洗膜3次， 分别加入相应的二抗孵育1 h后TBST洗膜3次， 最后化学发光法显影， 暗室曝光， 使用凝胶扫描仪扫描分析， 以Quantity One软件对条带进行分析。 　　1. 2. 4 细胞迁移与侵袭实验 细胞侵袭实验操作如下：镊子经乙醇消毒后， 置于培养箱中达到室温， 然后以其处理侵袭室内的嵌入物， 加入300 μl无血清培养基。各组细胞以无血清培养基重悬， 以血球计数板计数， 调整细胞密度约为5×108个。取200 μl细胞悬液加入侵袭室上室嵌入物， 下室加入500 μl 胎牛血清（FBS）高