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丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 2011级临床2班第二实验小组 （一）实验目的 ： 1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。 2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 （二）实验原理： 琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。本实验用甲烯蓝（MB）作为受氢体，蓝色甲烯蓝接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的甲烯白（MBH2）。 丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争性抑制琥珀酸脱氢酶。通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量亚甲蓝退色的程度，从而鉴定丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用和抑制程度。 （三）实验材料与仪器： 1器材 大白鼠、手术剪、镊子、滴管、漏斗、纱布、刻度吸量管、烧杯、研钵、恒温水浴箱、试管和试管架 2试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二酸溶液、1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。 （四）实验步骤: 1、酶提取液制备：取大白鼠骨骼肌，用冷水洗3次，加入1/15mol/L pH7.4磷酸缓冲液。在研钵中捣碎，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤液备用。 试管6，取酶提取液后应在100℃的水浴加热煮沸5min。 各管溶液立即混均匀，沿试管壁加入液体石蜡，约0.5ml，各管置于37℃的水浴中保温5~15分钟，切勿摇动试管，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间 。 【注意事项】 ： 1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。 4.、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。 * + MB COOH CH CH COOH + MB·2H COOH CH2 CH2 COOH 琥珀酸 甲烯蓝 延胡索酸 甲烯白 琥珀酸脱氢酶 无氧条件 5 10 \ \ \ 10 \ 2 试管6 5 10 \ \ \ 10 2 \ 试管5 5 \ \ 10 10 \ \ 2 试管4 5 \ \ 10 \ 10 \ 2 试管3 5 \ 10 \ \ 10 \ 2 试管2 5 10 \ \ \ 10 \ 2 试管1 甲烯蓝（滴） 蒸馏水（滴） 0.02mol/L丙二酸溶液（滴） 0.2mol/L丙二酸溶液（滴） 0.02mol/L琥珀酸（滴） 0.2mol/L琥珀酸(滴） 磷酸缓冲溶液(ml) 酶提取液（ml) 2、取试管6支，编号，再按表步骤操作 *