第7章第2节PCR技术3LMJ.ppt

* * * 2.定点点突变 (1) 5’端引入点突变： (2) 序列中的点突变： 通过修饰上游引物的5’端的碱基序列，可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。 采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR。 * * PCR 用酶A和B消化、克隆，将突变位点引入PCR重组体。 (1) 末端引入点突变 A B P2 P1 A B * * EcoRI HindIII Isolate products, mix Amplify digest, subclone sequence PvuII (2) 序列中的点突变： * * 例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建 肺炎链球菌S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗： 首先设计4个引物：(M1和M2完全重叠) P1: 5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’ BamH I P2: 5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’ Xho I M1: 5’-GGTCAATAATGTCCCA---AGAATGCAGTATG-3’ M2: 5’-CATACTGCATTCT---TGGGACATTATTGACC-3’ * * 突变位点 M2 M1 P2 P1 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 为酶切位点序列 以基因组DNA为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断； 2.以上下游片断为模板，以P1和P2为引物扩出全长； 3.酶切后克隆到质粒中保存。 * * A B P1 P2 P3 P4 PCR A B PCR A B 3.引入大片段缺失 * * 4.多位点突变 策略：多次重叠PCR 关键：重叠引物设计(每对均需部分重叠，方向相反)。 * * 基本操作 * * （三）DNA的微量分析 PCR技术敏感度很高，理论上只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段，是DNA微量分析的最好方法。 实际工作中，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要。 * * （四）mRNA的含量分析 用于RNA检测的常用字方法有原位杂交、点杂交、Northern印迹杂交及核酸酶保护试验等，都难以检测低丰度的mRNA，且操作繁琐。 在敏感性方面，RT- PCR用于mRNA定量分析要远高于上述传统方法。 RT-PCR用于mRNA定量分析面临的问题： 在第一步合成cDNA的反应中会造成一些误差，但是更重要和显著的误差是由PCR反应本身造成。 * * 用于定量PCR分析的两种技术： 竞争性定量PCR： 在反应前加入外源标准品RNA作为内参照；须使用与样品RNA同样的引物识别序列，但产物的大小不同，以在电泳时区别开。 属反应终点分析方法，需用系列稀释标准RNA做成标准曲线，样品RNA的含量应在标准曲线范围内。 实时PCR(real time PCR)： 是近年发展起来的一种RNA微量分析技术；精确度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。 * * 实时PCR的基本原理 在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。 不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系统不同： Molecular Probe 公司的SYBR? Green 系统 Perkin-Elmer/ABD公司的TaqMan系统 Invitrogen公司的Molecular Beacons系统 * * 原理: PCR扩增时，Taq酶的5’- 3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光； 每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 * * 思考题 3 1.实时荧光PCR—TaqMan技术 R Q 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 实时荧光PCR—TaqMan技术 * * TaqMan技术的优、缺点 优点：杂交效率高 缺点： (2) 探针的水解依赖于Taq的酶外切活性， 故受酶性能和试剂质量影响； (3) 检测点突变的能力相对不足。 (1) 淬灭难以彻底，本底较高； * * R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 2.实时荧光PCR—分子信标技术 * * 分子信标技术的优、缺点 优点： 荧光本底低。荧光基团和淬灭基团极端靠近；淬灭基团为非荧光物质，不存在对供