光损伤大鼠视网膜TNF―α表达变化及米诺环素对其表达影响实验研究.docVIP

光损伤大鼠视网膜TNF―α表达变化及米诺环素对其表达影响实验研究 　　【摘 要】目的：观察光损伤大鼠视网膜肿瘤坏死因子（TNF）-α表达变化的规律，及预先使用米诺环素（Minocycline，MC）对其分泌表达的影响，探讨视网膜光损伤的损伤机制和防治措施。方法：54只SD大鼠，随机分为光照对照组、光照实验组、正常对照组，前两组再各分为光照后6h、3d、7d、14d组，每组各6只大鼠（12只眼）。光照前90min，光照实验组大鼠MC灌胃（45mg/kg），光照对照组大鼠等量PBS液灌胃。分别于预定时间点取眼球，左眼石蜡包埋、HE染色、TNF-α免疫组化染色，计算机图像分析软件（Image-Pro Plus，IPP）测量视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）厚度。右眼球摘除后即刻完整取出视网膜，匀浆后取上清液，ELISA法测定TNF-α的吸光度（O.D）值并计算出TNF-α浓度。SPSS行统计分析。结果：1，正常对照大鼠视网膜形态正常，TNF-α未见阳性染色，ELISA定量仅含微量。2，光照对照组视网膜6h即出现病理改变，3d和7d进行性加重，14d略有减轻。视网膜TNF-a阳性表达6h开始增加，3d显著增加，7d减少，14d进一步减少，ELISA定量结果和免疫组化结果相平行。各时间点ONL厚度、TNF-a表达量和正常对照组相比，P值均0.05。TNF-a表达量均较光照对照组同一时间点为少，两两比较P值均P0.05。结论：本实验首次研究了光损伤大鼠视网膜TNF-α定位和定量的表达变化，及预先使用米诺环素对TNF-α表达变化和视网膜病理损伤的影响，结论如下：1.光损伤时过度表达的TNF-α参与并加重了视网膜光损伤。2.MC能减少光损伤大鼠视网膜感光细胞的丢失，对视网膜有保护作用，该作用主要通过抑制TNF-α分泌细胞的活性、减少TNF-α的过度分泌实现。3.分泌TNF-α的小胶质细胞参与了视网膜光损伤的病理生理过程。 　　【关键词】视网膜光损伤；米诺环素；免疫组织化学 　　视网膜光损伤发病机制和药物防治的研究是最近几十年来眼科领域一个基础结合临床的重要课题，其中光化学损伤最常见。特别是近年来，各种眼科光学诊疗器械光源所致视网膜损伤等问题已越来越引起人们的注意，视网膜光化学损伤还是视网膜变性类疾病的良好动物模型，其病理过程与年龄相关性黄斑变性及视网膜色素变性有许多相似之处[1]，而这两种疾病到目前为止尚无有效的防治方法。所以对视网膜光化学损伤的继续深入研究有着重要的理论和临床实用价值。本实验意在探讨视网膜光损伤的发病机制，及为其有效防治提供实验依据。 　　1材料和方法 　　1.1实验动物及分组 健康雌性SD大鼠54只（8～10周），体重200±20g，检查无眼疾。随机分为光照对照组（PBS灌胃）、光照实验组（MC灌胃）和正常对照组，前两组再分别分为光照后6h、3d、7d、14d组，每组分别6只大鼠（12只眼）。 　　1.2光损伤建模 采用自制光损伤装置（1m×1m×1m）（图1，图2）。所有实验用大鼠（包括正常对照组）均于光照前暗适应24小时。光照前90分钟，光照实验组大鼠0.5%MC溶液灌胃（9ml/kg/只），光照对照组大鼠等量PBS溶液灌胃。正常对照组大鼠未予任何处理。用光照强度为1737.9±393.0lux的绿色荧光灯作为致伤光源，连续照射36小时。光照结束后送回暗环境饲养。 　　1.3组织标本的获取 预定时间点，3%戊巴比妥钠按1ml/kg腹腔内注射麻醉，迅速摘除双侧眼球（包括球后视神经约3mm）。追加3%戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠。右眼球立即放入盛有PBS液的玻璃皿中，双目立体显微镜下完整取出视网膜并用PBS液再次冲洗，立即称取湿重后，按重量体积比1：2加入样品稀释液，低温下研磨匀浆视网膜后，移入离心管中，低温离心机， 10000rpm、4℃下离心20min。收集全部上清液，-20℃备用做ELISA检测。左眼球立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定48小时后，去除眼前节和玻璃体，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视乳头颞侧旁1mm纵向做切片。 　　1.4检测指标及方法 ⑴视网膜TNF-αELISA检测；⑵常规HE染色；⑶TNF-α免疫组化。 　　1.5结构改变，并测量光照对照组、光照实验组各时间点和正常对照组ONL厚度，求其均值代表这张图片ONL的厚度，并以此作为视网膜光感受器最终丧失的判断指标。各指标以均数±标准差（X±SD）表示）。光镜下比较、分析TNF-α免疫组化切片的染色动态变化及定性、定位变化。用SPSS 15.0 For Windowss进行统计分析。统计方法：各组各时间点的比较用单因素方差分析，光照组和正常对照组之间的两两比较及两组同一时间点比较采用配对t检验，P0.05表示