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7 高等动物基因工程 　　　　多利的基因母亲 普通白绵羊 乳腺细胞 细胞核 剔除了细胞核的苏格兰黑脸羊的卵子 　　科学家当时一共培育了277个胚胎，最后只有多利成功出生。体细胞克隆技术的低成功率，一直到现在也没有明显改善。　　克隆动物是否会早衰，是否可能有先天缺陷，是否应当允许科学家进行以培育完成人类个体为目标的克隆人研究，都是当前争论的热点问题。多利的健康状况因此受备关注。 １动物转基因技术的基本概念 动物转基因技术 　利用转基因的重组子构建技术，重组分子导入动物体内的转化技术，转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控制性表达技术统称为转基因技术． 转基因动物 指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。1981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。 根据不同的目的，转基因动物操作可以简单地划分为四种类型： （l）疾病型转基因动物； （2）利用转基因动物制药； （3）动物改良型； （4）基础生物学研究。 2、动物转基因技术程序 ①将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中； ②接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育； ③移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因； ④利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。 3、动物转基因的效率 动物基因转移的起点和终点分别为受精卵和含有整合转基因的动物子代。在这个过程中，转基因的效率极低。 以小鼠转基因为例： 注射外源基因后受精卵的存活率为86％； 将受精卵移殖到母鼠子宫内后受精卵的存活率为25％, 母鼠的怀孕率为80％, 转基因在基因组上的整合率为24％, 因此小鼠转基因的总有效率约为4％. 影响因素 １转基因性质 ２转基因的程序 ３外源基因的大小 动物转基因的结构 １基因组片段：分子量大，保持完整的基因结构 ２小基因：同一基因的某一或若干区域 ３融合基因：结构基因，非编码序列以及表达调控序列的来源不同 ４靶基因：结构基因或调控序列经过诱变或定向突变处理，然后重新输入回动物体内 ５插入基因：在动物染色体上随机或特异性插入的位点，根据需要也可以加装标记基因 ６置换基因；两侧含有其他的同源序列，用于动物基因的定位分离与克隆 动物转基因的表达特性 １转基因的时空特异性表达 　　相关基因的时序特异性和组织特异性 ２转基因的可控性表达 　　根据受体细胞的性质和启动子类型来摸索诱导被转基因的表达控制条件 ３转基因的共抑制效应 　　共抑制效应：当受体细胞染色体上含有转基因的同源伙伴时，转基因与内源性同源基因的表达将同时受到抑制． 共抑制效应的特征 １共抑制只发生在转基因与同源的内源性基因之间，对其他基因的表达不产生影响 ２如果转基因与内源性发生体内重组，则共抑制效应随之消失，基因表达恢复正常 ３共抑制现象的发生与结构基因编码区有关，但不依赖于启动子的来源和性质 ４两个相同的转基因之间也能发生共抑制效应 转基因导入动物体内的方法 胸苷激酶基因的选择系统 胸苷激酶(thymidine kinase, TK)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶,能够将胸苷转换为胸苷一磷酸. 在单纯疱疹病毒(HSV)中发现的tk基因,几乎在所有的真核细胞中都能有效地表达,所以选择为遗传标记基因. 该系统中, 首先要建立TK-表型的细胞株. 采用诱变加选择的方法: 在细胞培养时加胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷BUdR, TK催化其掺入细胞的DNA分子中,导致DNA复制出现错误. 具有BUdR- DNA的细胞对UV特别敏感,迅速被杀死,而少数TK-表型的细胞株存活. 目前最常用的是小鼠L细胞的TK-突变株(优点: 产生回复突变的频率低,而且容易被外源DNA所转化). HAT选择法 1962年E.H. Szybalska 和 W. Szybalski 设计的,由于选择TK+细胞的培养基中含有次黄嘌呤(hypoxanthine), 氨基蝶呤(aminopterin, APT), 胸苷(thymidine), 所以叫HAT选择法. 基本原理: 加氨基蝶呤APT, 二氢叶酸还原酶被抑制, 从而阻断dTTP, dATP, dGTP的重新合成途径; 加次黄嘌呤, 启动dATP, dGTP的补救合成途径; 加胸苷, TK+细胞能通过胸苷激酶的作用合成dTTP, 细胞继续存活;TK-细胞则死亡. 所以, 使用HAT培养基能够选择出由tk基因转化而来的TK+细胞. C 高等哺乳动物的载体系统 8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 人腺病毒DNA 猴空泡病毒DNA（SV4