凡纳滨对虾钙网蛋白cDNA序列克隆及组织表达分析.docVIP

凡纳滨对虾钙网蛋白cDNA序列克隆及组织表达分析 　　摘要：利用RACE技术，克隆了凡纳滨对虾钙网蛋白（calreticulin，CRT）基因（GenBank登录号：JQ682618）。该基因（LvCRT）cDNA全长1866 bp，含有1个长达1 221 bp的完整开放阅读框（ORF），编码的成熟肽由406个氨基酸组成，5′UTR（5′非编码区）长度为222 bp，3′UTR长度为423 bp，3′端加尾信号AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp处。预测其理论分子量是15.3 ku，等电点pI为4.90。具有1个保守的钙网蛋白家族标签（KHEQNIDCGGGYLKVF），1个信号肽（MKTWVFLALFGVVLVES）和保守的HDEL内质网回收标签。经NCBI BLASTX比对表明，LvCRT基因与中国明对虾和斑节对虾的LvCRT具有高度的相似性和一致性。系统进化分析表明，LvCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白基因。荧光定量PCR结果显示CRT在肌肉组织中表达量最低，在肠中的表达量最高。对凡纳滨对虾CRT基因全长cDNA序列克隆和表达的研究为更进一步了解CRT多肽在凡纳滨对虾中的重要功能奠定了基础。 　　关键词：凡纳滨对虾；钙网蛋白；基因克隆；表达 　　中图分类号：S917.4 文献标志码：A 文章编号：1002―1302（2016）01―0036―05 　　钙网蛋白（calreticulin，CRT）最初是由Ostwald等在兔肌肉细胞的糙面内质网中被发现的。近年来研究表明，CRT不仅存在于内质网腔中，在细胞表面和胞外基质中都有表达。Luan等研究表明，CRT在中国明对虾（Fenneropenae-us chinensis）肝胰腺、鳃、肌肉、肠、淋巴器官、血细胞和卵巢中均有表达，其中卵巢的表达量最高。成熟的钙网蛋白包括3个不同的功能?Y构域：N-功能域负责结构底物蛋白，P-功能域和C-功能域可以结合钙离子并使这种结合更加稳定。目前为止，已公布的甲壳动物的钙网蛋白序列包括中国明对虾Fenneropenaeus chinensis（DQ323054）、斑节对虾Penaeus monodon（HQ259085）和克氏原螯虾Pacifastacus leniusculus（HQ596362）。 　　作为内质网分子伴侣蛋白，钙网蛋白除了在细胞功能中扮演重要的作用，如内质网钙离子平衡和分子伴侣功能外，还参与了包括生长、繁殖、蜕皮、免疫功能、细胞凋亡和氧化及胁迫响应的多种生物学过程。本研究根据长期低盐诱导消减cDNA文库中差异表达基因的同源序列和RACE方法，克隆了凡纳滨对虾CRT（LvCRT）基因，并利用荧光定量PCR技术对其组织特异性表达进行了的分析，以期为凡纳滨对虾胁迫生理相关基因的克隆研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验动物 　　试验用虾购自广东海兴农生物科技有限公司，于广东海洋大学东海岛实验基地水泥池暂养1周，取健康凡纳滨对虾，经灭菌DEPC水清洗后，先将其冰浴麻醉，冰浴条件下分离血细胞、肌肉、肝胰腺、肠道和鳃共5种组织，迅速装入1.5 mLeppendoff离心管（RNase free），并立即投入液氮速冻，后转移至-80℃冰箱保存备用。 　　1.2总RNA的提取 　　取凡纳滨对虾血细胞、肌肉、肝胰腺、肠道和鳃共5种组织，按照联合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）的操作步骤，研磨、裂解组织后提取总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外可见分光光度计对提取的组织总RNA进行定性和定量检测。 　　1.3 LvCRT cDNA全长克隆 　　1.3.1 LvCRT cDNA片段的获得 根据构建的消减cDNA文库得到的LvCRT的EST序列（146 bp）和中国明对虾CRT保守序列，重新应用软件Primer Premier 5.0设计正反向引物（LvCRTF1/LvCRTR1）克隆中间片段，本试验中所有引物皆由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。PCR反应体系为20μL，反应条件为：95℃5 min；95℃60 s，57℃60 s，72℃60 s，35个循环；72℃10 min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用PCR产物凝胶回收试剂盒（OMEGA，USA）回收扩增片段，回收后与Easy Digestion T-vector（pED-T）（Si-noBio，Shanghlai）载体连接，并转入感受态细胞DH5α中。挑取阳性克隆菌落送往深圳华大基因公司测序，将所得LvCRT基因cDNA中间序列于NCBI中进行BLASTX同源性分析。 　　1.3.2 LvCRT cDNA 3′端和5′端的获得 根据SMARTerTM