基因工程和技术.docxVIP

绪论 基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质 DNA双螺旋结构和半保留复制机理 遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 基因工程的特征：1. 跨物种性2. 无限扩增 组成：上游和下游技术 基因工程研究的基本任务：开发人类需要的基因产物，这样的基因叫做目的基因。 连接酶 连接机理：a) ATP/ NAD+ + DNA 连接酶(E)→ E-AMP + PPi/NMN b) E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶 c) 活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′-磷酸二酯键，并释放出AMP 特点：（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）3）需要能量 分类：大肠杆菌DNA连接酶 T4 DNA连接酶 热稳定 DNA连接酶 影响因素：温度（粘性末端的Tm值，连接酶活性的最适温度。经常采用12.5℃（4-15℃）） DNA浓度（外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍） 环化（碱性磷酸酶预先处理质粒载体。） T4 DNA聚合酶：1、它是一种模板依赖的DNA聚合酶 2、3’ →5’DNA外切酶活性，可以将5’端突出末端补平或3’端突出末端削平。外切酶活性对于单 链DNA更高。 3、T4 DNA Polymerase的3→5外切酶活性比Klenow要高约200倍。 Klenow：1、双链D