化瘀降浊汤对转化生长因子―β1母系同源物家族信号通路相关蛋白影响.docVIP

化瘀降浊汤对转化生长因子―β1母系同源物家族信号通路相关蛋白影响 　　摘要：目的 观察化瘀降浊汤对转化生长因子（TGF）-β1诱导HK-2细胞发生上皮间质转分化（EMT）过程TGF-β/母系同源物家族Smad通路中关键因子E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Smad3、蜗形蛋白（Snail）的影响，探讨其保护肾功能的作用机制。方法 MTT法测定不同浓度化瘀降浊汤对TGF-β1诱导HK-2的细胞增殖抑制率，计算半数抑制率（IC50）。Western blot和RT-PCR检测E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和基因表达，间接免疫荧光检测E-cadherin蛋白表达。结果 化瘀降浊汤在一定浓度范围内抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖，呈现出一定的量效关系，IC50为472.017 μg/mL。Western blot和RT-PCR检测结果显示，化瘀降浊汤中、高剂量组E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和mRNA表达与诱导组比较，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）；免疫荧光检测结果显示，化瘀降浊汤能促进E-cadherin蛋白表达，与Western blot分析结果一致。结论 化瘀降浊汤可能通过调节HK-2细胞TGF-β/Smad信号途径中的关键蛋白达到抑制甚至逆转肾小管EMT，从而对肾小管间质纤维化起到保护作用。 　　关键词：HK-2细胞；上皮间质转化；化瘀降浊汤；E-钙黏蛋白；Smad3；蜗形蛋白 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.015 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0054-05 　　尿路梗阻性疾病引起的肾实质损害称为梗阻性肾病，对于泌尿外科而言，引起梗阻性肾损害主要原因为上尿路结石，梗阻性肾病发展为终末期肾病的关键病理变化为肾间质纤维化。上皮间质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是启动和维持肾间质纤维化的关键机制[1]。转化生长因子-β（TGF-β）/母系同源物家族（Smads）信号通路是调节EMT和肾间质纤维化的关键信号通路。前期研究表明，益气活血类中药能明显改善可复性单侧输尿管部分梗阻大鼠模型的的梗阻肾侧及总肾的肾小球滤过率（GFR）水平[2]。本实验观察化瘀降浊汤对TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT过程中的TGF-β/Smads关键信号通路蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Smad3、蜗形蛋白（Snail）的影响，探讨其保护肾功能的作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞 　　人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞，北京中医药大学东直门医院柴立民教授惠赠。 　　1.2 药物及制备 　　化瘀降浊汤（黄芪30 g，丹参30 g，桃仁30 g，莪术20 g，红花10 g）饮片均购自康美药业。将上述剂量的5倍中药一半置于煎煮容器内，以10倍剂量的双蒸水浸泡30 min，煮沸2 h，过滤药渣倒出药液，将另一半中药用10倍剂量乙醇煎煮，煎沸2 h，过滤药渣倒出药液，合并2次滤液。置于旋转蒸发器内，旋转蒸发制成膏剂、然后取出，置于真空干燥箱干燥48 h，将干燥的固体研磨成粉剂，用培养液分别配制成所需的浓度，然后滤器过滤，分装至50 mL离心管中保存。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　DMEM/F12（Invitrogen），胎牛血清（Hyclone），Anti-E-cadherin抗体、Anti-Smad3抗体、Anti-Snail抗体（abcam），Goat Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（CST），High Capacity RNA-to-cDNA Kit、E-cadherin探针、GAPDH探针、Smad3探针、Snail探针（Life Tech），免疫染色一抗稀释、免疫染色二抗稀释液、免疫染色封闭液、DAPI（碧云天），Trioton-100（索莱宝），FITC标记山羊抗兔IgG（碧云天），TaqMan Gene Expression Master Mix（Life Tech），Trizol Reagent（Invitrogen），MTT（Sigma），重组人TGF-β1（pepro tech），胰酶（杭州吉诺）。6、96孔细胞培养板（美国corning），PHS-2F酸度计（上海雷磁仪器厂），MCO-18AIC细胞培养箱（日本SANYO），DZF-6020真空干燥箱（上海-恒科技有限公司），RE52-05旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器），SIAFRT SYNERGYHT多功能酶标仪、nanodrop超微量分光光度计（美国Thermo Scientifi