朱顶红褪绿环斑病毒云南君子兰分离物S序列的克隆及分析.PDFVIP

— ３８— 江苏农业科学　２０１８年第４６卷第１４期 吴保为，吴家琪，胡玉洁，等．朱顶红褪绿环斑病毒云南君子兰分离物Ｓ序列的克隆及分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１４）：３８－４１． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１４．０１０ 朱顶红褪绿环斑病毒云南君子兰 分离物 Ｓ序列的克隆及分析 吴保为，吴家琪，胡玉洁，贾志强，高　雪，刘雅婷 （云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明６５０２０１） 　　摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ以及ＥＬＩＳＡ对采自云南省昆明市的君子兰样品进行鉴定，确定了其病原物为朱顶红褪绿环 斑病毒（ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍｃｈｌｏｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ＨＣＲＶ）。这是首次在君子兰（Ｃｌｉｖｉａｍｉｎｉａｔａ）中检测到番茄斑萎病毒属 （Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）病毒，为明确其序列特征，设计了ＨＣＲＶＳＲＮＡ全序列扩增引物，进一步克隆了该分离物的ＳＲＮＡ全基因 组序列，并进行了序列分析。结果表明，ＨＣＲＶ－ＣＭ分离物ＳＲＮＡ全长２７４９ｎｔ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＫＹ４８４８３６），与已 报道的ＨＣＲＶ基因结构一致。基于核壳体蛋白Ｎ基因序列的系统进化分析显示ＨＣＲＶ－ＣＭ与来自云南的ＨＣＲＶ株 系聚为一支，说明ＨＣＲＶ－ＣＭ与ＨＣＲＶ云南分离物亲缘关系较近。 　　关键词：朱顶红褪绿环斑病毒；君子兰；基因克隆；序列分析 　　中图分类号：Ｓ４３６．８１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１４－００３８－０３ 　　朱顶红褪绿环斑病毒（ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍｃｈｌｏｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔ １　材料与方法 ｖｉｒｕｓ，ＨＣＲＶ）属于布尼亚病毒科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）番茄斑萎病毒 属（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ），是２０１３年在中国云南省发现的番茄斑萎病 １．１　材料 ［１－２］ 毒属新种 。该病毒主要通过蓟马进行传播，能够系统侵 病毒样本于２０１６年７月１１日采自云南省昆明市云南农 染朱顶红、烟草、番茄、辣椒、蜘蛛兰等多种经济作物，引起植 业大学的君子兰叶片，保存至－８０℃超低温冷冻冰箱中。 ［３］ 物出现坏死、褪绿、同心环纹等症状，危害严重 。ＨＣＲＶ为 １．２　试剂 三分基因组，３段单链 ＲＮＡ序列从小到大分别为ＳＲＮＡ、Ｍ ＴｒａｎｓＺｏｌＰｌａｎｔ试剂盒、ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体、Ｔ１感受态细胞、 ＲＮＡ、ＬＲＮＡ，其中ＳＲＮＡ序列含有２个开放阅读框（Ｏｐｅｎ ＦａｓｔＰｆｕ酶、Ｂｕｆｆｅｒ及ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶、ＳｕｐｅｒＭｉｘ酶购自北京全式 ＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅ，ＯＲＦ），其正向编码 ４４４ａａ的非结构蛋白 金生物技术有限公司；胶回收纯化试剂盒，购自北京百泰克生 （ＮＳｓ），相关研究表明，ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓｅｓ编码的ＮＳｓ蛋白可能在病 物技术有限公司；ｄＡＴＰ、Ｍａｒｋｅｒ购自北京天根生化科技有限公 ［４］ 毒复制、转录、抑制ＲＮＡ沉默中起重要作用 。ＳＲＮＡ反向 司；ＴＳＷＶ、ＩＮＳＶ、ＩＹＳＶ、ＷＳＭｏＶ＆ＧＢＮＶ、ＧＲＳＶ＆ＴＣＳＶ抗体，购 编码２７５ａａ的核壳体蛋白（Ｎ），核壳体蛋白是研究 Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ 自美国Ａｇｄｉａ公司；ＨＣＲＶ、ＴＺＳＶ、ＣＣＳＶ、ＣａＣＶ抗体，由笔者所 ［５］ 病毒时，普遍最先获得的病毒序列，其序列特异性极高 ，因 在课题组制备；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购 Ⅱ 此，通常都是利用比对核壳体蛋白Ｎ基因的相似性来检测与