激光共聚焦的技术.ppt

激光共聚焦显微镜应用技术 －－蛋白的细胞器定位 分子生物学课件 激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。 它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。 成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。 激光共聚焦显微镜在生物学中的应用 原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 检测核酸 检测蛋白质细胞定位 检测细胞凋亡 细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪 活体细胞或组织功能的实时动态监测 实时定量测定细胞内Ca2+变化 测定细胞内pH变化 检测膜电位变化 检测细胞内活性氧物种的产生 检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位 检测荧光共振能量转移 检测荧光漂白恢复 荧光显微镜系统 激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。 需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。 需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。 荧光镜座要有防震动装置。 激光共聚焦显微镜基本操作 获取共焦图像的步骤 在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像 Z轴扫描 时间系列扫描 Z轴扫描＋时间系列扫描 组织和细胞样品中荧光的来源 自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光 荧光样品的制备要求 荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除 图象背景干净、干扰杂质少 荧光探针的种类及应用 原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、YFP等） 活体细胞或组织功能的实时动态监测 实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2 荧光探针标记样品的过程 样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品 百合花粉管钙离子浓度梯度检测 液体培养基中培养百合花粉 观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观察。 荧光探针 Fluo-3（/AM） 属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。 Fluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物， fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。 游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与Ca2＋结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内[Ca2＋]呈正相关，因此可以得到Ca2＋浓度。 另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙也有作用。 目的蛋白细胞器定位观察 含有荧光蛋白的载体pA7-GFP 目的基因 洋葱表皮 目的蛋白细胞器定位观察 含有荧光蛋白的载体pA7-GFP 目的蛋白细胞器定位观察 目的蛋白细胞器定位观察 目的蛋白细胞器定位观察 XbaI,SmaI,BamHI CaMV 35S Promoter XhoI,NcoI,SalI,SpeI GFP 目的基因 对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的 片段。 根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶 切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段 已经和质粒DNA重组。 图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物 含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞 将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱