高美华《医学免疫学》zlwestern-blot2014年秋季.ppt

可提取性核抗原（ENA）自身抗体检测Western Blot法? Western Blot是将蛋白质样品经过SDS分离后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原-抗体反应进行特异性检测。 本法综合了SDS的高分辨力和 ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，可分辨10-100 ng的蛋白质，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。 一、实验原理 Western Blot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行。 第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。 第二阶段：电转移。 第三阶段：固相酶免疫测定。 二、试验方法 （一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 试剂材料 1) 30 ％凝胶贮备液：含29 ％（W/V）丙烯酰胺和1 ％（W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中。 2) 10 ％ SDS，去离子水配制，贮存于室温中。 3) TEMED（N,N,N′,N′-四甲基乙烯二胺）。 4) 10％过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多4℃贮存一周。 5) 浓缩胶电泳缓冲液 Tris-HCl（PH 6.8）。分离胶电泳缓冲液Tris-HCl（PH 8.8 ）。 6) 电泳缓冲液：Tris-甘氨酸 （PH 8.3）。 7）上样缓冲液： 100 mmol/L Tris-Cl （PH6.8） 200 mmol/L 二巯基乙醇 10 % SDS 0.2 %溴酚兰 20 %甘油 8）ENA：用pH7.4 0.01 M PBS从牛胸腺丙酮粉中抽提，浓度为5 mg/mL，-70 ℃保存备用。9）垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴头、EP管、吸管等。10）考马斯亮蓝染液、丽春红染液。 2. 实验方法 1) 玻璃L准备：依次用水、10 ％SDS、H2O、乙醇和水冲洗，干燥。 2) 配制分离胶：总量5 mL，其中： 水 1.65 mL 30 ％丙烯酰胺溶液2.0 mL 1.5 mol/L Tris-HCl（PH 8.8） 1.25 mL 10 ％ SDS 0.05 mL 10 ％过硫酸铵 0.05 mL TEMED 0.002 mL 3) 配制浓缩胶：总量2ml，其中： 水 1.385 mL 30 ％丙烯酰胺溶液 0.325 mL 1.0 mol/L Tris-HCl（PH6.8） 0.25 mL 10 ％SDS 0.02 mL 10％过硫酸铵 0.02 mL TEMED 0.002 mL 将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子，应小心避免气泡。 4) 加样：将ENA与上样缓冲液等体积混合，煮沸3~5 min后，将其加入梳孔内，每孔20 ?L。 5) 电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 6) 染色：取下凝胶，切下一部分染色，其余用于电转移。 （二） 电转移： 蛋白蛋从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜 一、材料 转移缓冲液、转移电泳槽、电泳仪、稳压器、PVDF膜、Whatman3MM滤纸、海绵等 二、方法 1．剪6块滤纸和一块PVDF膜，其大小应与SDS凝胶的大小相同。如果纸或膜比凝胶大，在转移过程中会形成局部短路影响转印效果。 2．将剪好的3MM滤纸及PVDF膜在甲醇中提前浸泡5-10 min。 3、按下列过程安装转移装置： （1）将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。 （2）将3块3MM滤纸对齐放在海绵上，依次放置PVDF膜、凝胶、另外3块3MM滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。 （3）最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意PVDF膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。 海绵 3层滤纸 塑料支架 3层滤纸 海绵 塑料支架 PVDF膜 凝胶 + -- 4、接通电源，电压40 V，电流0.17-0.2 A，转移1.5-6 h，转移时间可根据靶蛋白的大小来定，蛋白质分子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长。 5、转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用