3-PCR和DNA测序2011幻灯片.pptVIP

常用PCR仪 总结 PCR 技术要点： 常用的PCR技术 热启动PCR TD-PCR(touch down PCR,TD-PCR) 巢式PCR 反向PCR 锚定PCR 荧光定量PCR RT-PCR 不对称PCR 1、热启动PCR 热启动PCR（hot start PCR）是一种改良的PCR方法，可有效避免非特异性扩增。 将DNA聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，避免在未达到设定温度前就开始反应。 热启动PCR有几种方式： 蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反应物加入PCR管后，加滴熔融的石蜡；待石蜡凝固后再加入聚合酶。放入PCR仪开始反应升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反应物混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。 热启动聚合酶（化学型）：经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动。 热启动聚合酶（抗体）：带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动。 热启动聚合酶（共价键结）：改良自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离。 2、TD-PCR 即touchdown PCR，降落PCR。 指每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，直至达到一个较低的退火温度（touchdown退火温度）。然后以此温度进行10个循环。 正确和非正确退火温度1℃差异将造成PCR产物量4倍的差异，如果相差5℃，就会产生4的五次方（1024）倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。 退火温度起始在高于计算的Tm值15℃左右，再接下来的循环中，退火温度以每次1-2℃逐渐降低，直到Tm值以下5℃，当达到特异的引物-模板结合的Tm值时，扩增就会开始。 当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。 此法扩增可利于PCR产物纯化。 TD-PCR注意事项 由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。 设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。 3、巢式PCR Nested PCR 利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 4、反向PCR PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，而反向PCR则可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。 反向PCR方法的不足 ①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。 ②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，因此，反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 5、锚定PCR 锚地PCR技术是 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 6、RT-PCR 反转录RCR（reverse transcription PCR,RT-PCR） 实时荧光定量PCR（real time PCR,RT-PCR） 7、RACE技术 RACE：快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification cDNA End)技术，获得全长cDNA的快速有效的方法。 RACE法就是通过向cDNA末端加尾，根据已知序列和加尾 设计引物扩增 获取cDNA末端未知序列的方法。 5‘ RACE 和 3RACE的原理不一样 Takara公司3 RACE和 5 RACE 试剂盒原理 3’RACE的局限性及注意事项 3’末端RACE相对容易，因为存在一个poly(A)，而且降解往往也不是从3末端开始的。 局限性： 细菌和一些病毒的基因组的3’末端通常没有poly（A），这个方法就不适用； 而且在有一些RNA中，这个poly(A)也容易丢失 解决办法：可以通过poly(A)聚合酶在末端加A即可 RNA中加入RNA酶抑制剂，很有利于保持完整的RNA 5’RACE的局限性 通常，提取的RNA都会有些降解，而RNA的降解是从5’端开始的，所以用5’末端磷酸化的RT-primer去拉的时候，5’末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几Kb以上的，就更不能保证该引物能将5’末端拉全。 Takara公司的5’RACE新方法 对5race做一点说明 这个方法其实存在着很大的局限。 因为我们平时提RNA时，一般多少都有些降解，而RNA的降解是从5’端开始的，所以你用5末端磷酸化的RTprimer去拉的时候，5末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几Kb以上的，就更不能保证该prime能将5末端拉全。 8、SMART技术—全长cDNA文库的构建技