PCR_引物设计及相关软件数据裤的使用幻灯片.pptVIP

1. 上游引物位置.. 163bp-183bp，与模板结合的位置为163-1的位置，输入162. 2. 上游与模板结合后，序列是完全一致的。 1. 下游引物位置.. 307bp-327bp，与模板结合的位置为307的位置. 2. 下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。 引物分析 Hairpin Dimer and cross Dimer GC% Total PCR information 1. 检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。 2. 发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好 3. 检查为GC 含量，以45-55％为宜 4. 检测与PCR其他模板上错配的位置。 1. 引物二聚体分析 2. 引物发夹结构分析 3. 引物GC比值分析 4. 引物在模板上错配概率 下游引物分析结果 Primer Premier 5.0使用介绍 Primer Premier 5.0使用介绍 主要功能：用于引物的检索 Preimer Premier 启动界面 Load sequence Choose a function 第一步. 输入基因的序列 第二步.搜索上下游引物在基因序列中适合的位置。 第三步.引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 13个引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 第四步，选择引物搜索的结果 第五步.检测软件设计的引物 是否出现引物自身发夹结构，二聚体，错配位点等 上游引物搜索结果 下游引物搜索结果 第六步，获取引物信息 引物及产物信息 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 … 引物设计软件小结 PCRDESIGN （分析评价引物的功能，简单方便） Oligo 6.0 （分析评价引物功能，最优秀） Primer Premier 5.0 （自助搜索引物的功能） Oligo 6.0与Primer Premier 5.0 搭配使用，可快速设计出成功率高的引物。 引物特异性检测 设计PCR引物后，需要对引物的特异性进行检测。 检测引物是否能与基因组或cDNA数据库中其他位置结合，扩增出非特异性条带。 —Primer Blast Primer-BLAST可以直接从Blast主页进入： （/） Primer Blast也可以直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/ 提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区） 1. 在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。 输入验证引物 根据需要设置外显子与内含子选项 在specificity check区： 4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome, and nr；多个物种（人，鼠） 。 Primer-blast 软件检测结果 检测结果显示： HMGB2基因虽然有相似区，但是3’端没有完全互补，因此该引物只能特异性地扩增HMGB1基因，不能扩增出HMGB2基因。 Primer-blast 软件检测结果 下 午 序列查找及引物的设计 教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引物（13：30-15：00） 根据不同的实验目的设计引物，比如全长，部分 总结自己所遇到的问题及解决方法，与他人分享 The mRNA sequence of Homo sapiens interferon, alpha 1 is as followed: 1 agaacctaga gcccaaggtt cagagtcacc catctcagca agcccagaag tatctgcaat 61 atctacgatg gcctcgccct ttgctttact gatggtcctg gtggtgctca gctgcaagtc 121 aagctgctct ctgggctgtg atctccctga gacccacagc ctggataaca ggaggacctt 181 gatgctcctg gcacaaatga gcagaatctc tccttcctcc tgtctgatgg acagacatga 241 ctttggattt ccccaggagg agtttgatgg caaccagttc