噻呋酰胺人工抗原合成及酶联免疫吸附分析方法建立.docVIP

噻呋酰胺人工抗原合成及酶联免疫吸附分析方法建立 　　摘要以化合物2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA）为噻呋酰胺的半抗原合成人工抗原，采用活泼酯法合成免疫原MCABSA，分别采用活泼酯法、混合酸酐法和N，N羰基二咪唑/二甲氨基吡啶（CDI/DMAP）法合成3种包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。免疫动物后，最终以包被原MCAOVA3筛选并获得了具有高特异性的噻呋酰胺多克隆抗体，建立了检测噻呋酰胺的间接竞争酶联免疫吸附（icELISA）分析方法。本方法线性检测范围为008～1000 mg/L，半数抑制浓度（IC50）为139 mg/L，检出限为008 mg/L，对自来水、湖水和小麦中的噻呋酰胺添加回收率在720%～1283%之间，检测结果与PLC法具有良好的相关性（R2=0999）。本研究建立的icELISA方法可用于环境水样与小麦等农产品中噻呋酰胺残留的快速检测。 　　关键词噻呋酰胺； 人工抗原； 多克隆抗体； 酶联免疫吸附分析 　　1引 言 　　噻呋酰胺是一种用途广泛的含氟杀菌剂，可有效防治谷物、水果、蔬菜中的多种病害，对纹枯病有特效[1]。噻呋酰胺在水稻和花生中的半衰期分别为91～16 d和91～116 d，而在土壤中的半衰期更长[2，3]。Yang等[]研究发现噻呋酰胺可引起斑马鱼的胚胎发育畸形以及肝脏和肾脏组织损伤。随着噻呋酰胺用量的增加，消费者在日常生活中与之接触的风险也在逐渐升高，使消费者健康受到威胁，因此其残留情况不容忽视。我国国家标准GB5]中规定噻呋酰胺在稻谷、糙米和马铃薯中的最大残留量（MRL）分别为7、3和2 mg/kg。 　　现有的噻呋酰胺残留的检测方法包括高效液相色谱法（PLC）[6]、气相色谱法（GC）[7]、超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）[8]等，此类方法操作复杂、耗时耗力，而且依赖大型仪器和专业操作人员。建立简单、快速、灵敏和不依赖于大型仪器的方法，对于农药日常监管和残留的快速筛查都具有重要的实际意义，而酶联免疫吸附分析方法（ELISA）可以满足上述要求[9]。 　　噻呋酰胺的分子结构中无活泼基团，难以直接与载体蛋白偶联制备其抗体。Rejeb等[10]对噻呋酰胺的分子结构进行改造，使用的半抗原包含了噻呋酰胺的整个分子结构，但仅用获得的抗体制备了噻呋酰胺免疫吸附层析柱，并未详述半抗原的制备方法，也未建立起ELISA检测方法。本研究尝试以噻呋酰胺分子结构一半的化合物作为半抗原，通过不同的方法合成噻呋酰胺人工抗原，最终用获得的高特异性抗体建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法（icELISA），可对环境与农产品中的噻呋酰胺残留进行检测。 　　2实验部分 　　21仪器与试剂 　　UV2700紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）； DNM9602型酶标仪（北京普朗新公司）； Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。 　　噻呋酰胺（98%，上海将来实业有限公司）； 2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA，98%，上海书亚医药科技有限公司）； 氯甲酸异丁酯（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体IgG（酶标二抗，武汉亦新生物技术公司）； N， N羰基二咪唑（CDI，99%）、二甲氨基吡啶（DMAP，99%）、环己基碳二亚胺（DCC，99%）、N羟基琥珀酰亚胺（NS，98%）购于成都西亚试剂公司； 三正丁胺（99%）、牛血清蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、福氏完全佐剂（CA）、福氏不完全佐剂（ICA）购于Sigma公司； 底物显色液为邻苯二胺（OPD）显色液（OPD mg，02 mol/L Na2PO 257 mL， 01 mol/L 柠檬酸23 mL，d2O 5 mL，30% 2O2 μL，现用现配）； 其它试剂均为国产分析纯或色谱纯。 　　22实验方法 　　221人工抗原的合成采用活泼酯法[11]合成免疫原MCABSA； 采用活泼酯法[11]、混合酸酐法[12]、CDI/DMAP法[13]分别合成包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。所有人工抗原均采用紫外吸收光谱扫描鉴定。 　　222动物的免疫将只周龄的雌性Balb/c小鼠用MCABSA免疫，免疫方法按文?I[1]进行。 　　223小鼠血清效价及灵敏度的检测第次免疫结束后第7天，将小鼠断尾取血，收集血清。采用间接ELISA方法检测小鼠血清效价：将3种包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3用包被缓冲液稀释到1 μg/mL [15]，包被酶标板，℃包被过夜。用3% 脱脂奶粉封闭，250 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入2倍梯度稀释的系列浓度（从1000～128000倍）的血清，