地塞米松平阳霉素对血管瘤内皮细胞作用.docVIP

地塞米松平阳霉素对血管瘤内皮细胞作用 　　[摘要]目的：观察地塞米松（Dexamethason，DX）、平阳霉素（Pingyangmycin，PYM）对体外培养的人血管瘤内皮细胞（Hemangioma endothelial cell， HEC）生长的抑制作用。方法：以MTT法检测PYM、DX作用于HEC细胞活性并筛选有效浓度。以有效浓度的PYM、DX作用于HEC，光镜下观察HEC形态，MTT检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期并计算细胞增殖指数（PI）。结果：药物作用后，光镜下见HEC发生坏死改变。MTT检测显示吸光度降低（P0.05）。流式细胞术检测示内皮细胞G1 期细胞比例增多（P0.05）；S期细胞比例下降（P0.05）；G2 期细胞比例下降（P0.05）。两种细胞的PI均降低（P0.05）。结论：PYM和DX可直接损伤DNA，阻滞细胞周期；PYM可直接杀伤HEC，DX使细胞皱缩成圆形，细胞连接中断，从而抑制血管生成和中断血管的连续性。相比较，PYM对HEC的抑制作用较强。 　　[关键词]血管瘤；平阳霉素；地塞米松 　　[中图分类号]R732.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）01-0030-04 　　血管瘤和血管畸形的治疗方法很多[1]，主要有口服或局部注射糖皮质激素、抗肿瘤药物局部注射、口服干扰素、激光治疗、硬化剂注射治疗、放射治疗等，但各有其局限性。目前，对平阳霉素和地塞米松治疗血管瘤的知识主要来自于临床疗效观察和少数细胞水平的研究，其中研究所选细胞均为正常血管的内皮细胞，与增生期血管瘤内皮细胞增殖活跃是不同的，因此其研究针对性强。本研究通过体外培养HEC，将目前临床常用的PYM和DX进行干预实验，以期观测这两种药物的药效及作用机制，为下一步的基础和临床研究工作提供一定的科研依据。 　　1 材料和方法 　　1.1研究对象 　　收集笔者医院和昆明医科大学附属二院整形外科2009年10月-2011年12月经手术切除的18例皮肤血管瘤（原称草莓状血管瘤）组织，其中男7例，女11例，年龄40天～8岁，平均为1岁2个月。血管瘤标本在切除后半小时内送实验室。 　　1.2方法 　　1.2.1 HEC的原代培养及传代： 将无菌标本送细胞培养室，于超净工作台（苏州苏净集团）内去除皮肤和脂肪组织，用D-Hanks液冲洗后剪切成1mm×1mm×1mm 大小的组织块，将组织块置入培养瓶内行组织块法原代培养，并行常规传代培养。 　　1.2.2 PYM、DX对HEC增殖抑制的检测：采用MTT法检测不同浓度的PYM、DX对HEC增殖的抑制作用并确定最适浓度。选取3～5代的HEC，常规传代以细胞密度约5×106/孔分别接种于3块96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μl，移入37℃、5%CO2 孵箱培养24h。细胞生长至铺满80%孔底后，实验组加入6个不同浓度梯度的PYM（1×10-2μg/m1～1×103μg/m1）、DX（1×10-5μg/m1～1×100μg/m1）培养液，每个浓度设5个复孔，并设阴性对照孔（未加药物）和空白孔（无细胞），3块板继续培养不同时间（12h、24h、36h）后进行MTT 实验。先吸去孔内培养液，每孔加入MTT溶液20μl，37℃、5% CO2恒温孵箱培养4h，终止培养，弃上清液。每孔加 DMSO 150μl，在酶标仪内振荡10min，于492nm 波长处测定各孔吸光度（A值）。每组实验重复5次，取平均A值。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。根据以下公式计算各个药物浓度的细胞存活抑制率：抑制率=（1-加药细胞A值/对照细胞A值）×100%。通过药物浓度和相应的抑制率计算半抑制率 IC50，光镜下观察细胞改变。最后确定最适浓度为 PYM102μg/m1、DX 100μg/m1，光镜下观察细胞改变。 　　1.2.3流式细胞仪检测HEC周期各个时相的分布：将3～5代的HEC置入培养瓶内传代，待细胞贴壁后加入无血清M199培养液继续培养16h。分三组进行如下实验：实验组分别加入1×102μg/m1的PYM、1μg/m1的DX；阴性对照组加入含10%胎牛血清M199培养液；空白对照组加入PBS液。继续培养24h后，用胰酶消化制成单细胞悬液（1.0×105/ml），离心沉淀，PBS漂洗，70%乙醇固定，4℃保存，送检。 　　1.3 统计学分析 　　采用SPSS 13.0 医学统计软件包作统计学分析，实验数据以x±s表示，进行单因素方差分析和均数间的多重比较。检测水准均为P=0.05。 　　2 结果 　　2.1 形态学观察 　　药物作用后，与 M199组比较， HEC均发生坏死改变（见图1～3），PYM作用后，细胞出现明显弥漫性崩解和大量坏死脱落，可