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蛋白在細胞中之定位技術 Distributions of Cellular Proteins .tw/department/anatomy/chien/C03.pdf 錢宗良 台大醫學院 解剖學暨細胞生物學研究所 前言 •由於後基因體時代的來臨，新發現且具有功能的 基因產物蛋白質在細胞中的分佈，即成為近日研究 的重要課題。 • 特殊蛋白質從細胞、組織、乃至於生命個體中的 生理功能，常可由其在細胞的生成與分佈而推斷得 知。 • 細胞胞器類別，分別介紹蛋白質，在各胞器分佈 的可能機制。並介紹一些目前研究蛋白質的常用細 胞生物學方法，以期運用在基因體學研究，奠定並 釐清功能性蛋白質的學理基礎。 1 細胞核 (Nucleus) (Protein sorting, movie) •大多數的核內功能性蛋白質由細胞質中的核醣體合成再運送至細胞核中，如調控 細胞基因表現的轉錄因子 (transcriptional factors) 。 細胞核 (Nucleus) 目前已知許多核內功能性蛋白質在其氨基酸序列上均具有一段特殊的訊息序列如• – Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- ，稱為核轉置訊息(Nuclear Location Signal, NLS) 。如果在新發現的蛋白質中，藉由序列比對找到此NLS訊息序列，即可推斷 此蛋白質合成後可能會被送入細胞核中。 •此分佈機制只是針對較大分子的蛋白質，這些蛋白質須要靠核輸入接受器 (nuclear import receptors) 來辨識NLS訊息序列，進而與特殊運送蛋白 (cargo proteins)結合，藉由主動運輸 (active transport)將其穿過核孔(nuclear pores)而 送入細胞核中。 2 細胞核 (Nucleus) •對於一些較小分子的蛋白質，則不須要具備此NLS訊息序列與特殊運送蛋白，可 藉由擴散或是其他運送機制穿過核孔而送入細胞核中。基本上，蛋白分子大於 60,000 daltons即不太可能藉由擴散自行穿過核孔而進入細胞核中；對於較小分子 的蛋白質的擴散，如 5,000 daltons以下的蛋白質，核孔是完全通透的。 細胞核 (Nucleus)定位 1. 為瞭解新發現的蛋白質是否真能送入細胞核中，可藉由細胞轉殖實驗(cell transfections)或免疫細胞化學 (immunocytochemistry)染色 (如有很好的專一 性抗體) 。 2. 再與DNA特殊染色如DAPI (激發光譜約為 359 nm ；與DNA接合後釋放光譜約為 461 nm)或是 Hoechst33342 (激發光譜約為 343 nm ；與DNA接合後釋放光譜約 為483 nm) 等染色來做對比，即可將標示蛋白質是否在細胞核中。 膀胱癌 T24細胞螢光染色 Hoechst 33342標示細胞核呈藍色， 在細胞質中 MitoTracker標示粒線體 呈紅色， Keratin 18中間絲蛋白則呈 綠色絲狀分佈。Scale bar = 20µm 。 3 粒線體 (Mitochondria) 粒線體的蛋白質合成除了少部份由粒線體自身基因體(mitochondrial genome)轉錄轉譯而成外，大部份的蛋白質仍由細胞