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地丁豆根白术汤抗肿瘤作用实验研究 　　[摘要] 目的 研究地丁豆根白术汤的抗肿瘤作用。 方法 用地丁豆根白术汤复方中药水提取物作用肿瘤细胞（sp2/0）和正常细胞（CEF）24 h，显微计数研究复方中药对肿瘤细胞的杀伤作用；流式细胞技术和AnnexinⅤ-FITC/PI探讨复方中药对肿瘤细胞的杀伤机制；腹腔注射sp2/0细胞建立小鼠同源腹水型肿瘤模型，灌胃给药，研究复方中药对发病小鼠的治疗作用。 结果 2.4 mg/mL的复方中药水提取物作用24 h后，可完全杀灭sp2/0细胞，而对CEF细胞无明显杀伤作用；2.4 mg/mL的复方中药可通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞，药物作用2 h时凋亡比率达到峰值（58.77%）；60 mg/d的药量能明显减少小鼠腹腔肿瘤的数量、大小，明显延长小鼠寿命。 结论 该复方中药对恶性肿瘤有一定的控制和治疗作用，可以作为治疗恶性肿瘤的药物做进一步研究。 　　[关键词] 地丁豆根白术汤；恶性肿瘤；凋亡；小鼠 　　[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）33-0025-03 　　中药已经被用到多种癌症的治疗过程中，包括中药单体提取物[1]和复方中药[2]。这些中药在体外诱导肿瘤细胞凋亡和皮下抑瘤方面有一定的作用[3]，但少有实际应用上的报道，因而无法判断其在实际应用中的效果。深入考虑，当前对于中药治疗肿瘤的研究方法似乎存在一些不合理之处。因为人在自然条件下发生的类似于小鼠皮下的肿瘤[4]尚未见报道，长达24 h和48 h的中药体外作用时间[1]过长。我们知道口服中药4 h左右就会达到最高血液浓度并且半衰期出现在其后的1～3 h内[5]。因此，我们只有选取能在体外快速起效的药物，才有可能在治疗肿瘤的过程中有一个较好的效果。本研究使用辛同强医生组配的地丁豆根白术汤复方中药展开研究。首先选取一个适宜的药物浓度――在体外条件下，该浓度中药对肿瘤细胞（sp2/0）有明显的杀伤作用，而对正常细胞（CEF）生长情况影响较小。然后，通过流式细胞技术研究该药杀伤肿瘤细胞的机制。随后进行灌胃治疗小鼠腹腔肿瘤试验。 　　1 材料与方法 　　1.1材料 　　雄性BALB/C小鼠购自山东大学，sp2/0细胞和Hela细胞保存于本实验室，CEF细胞分离自SPF鸡胚，DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒购自嘉美生物公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 所有的细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。 　　1.2.2 中药提取物的制备 所有中药组分在去离子水中浸泡4 h，用电磁炉中火煎煮2 h。水提取物3000 r/min离心10 min，用0.22 μm直径的细菌滤器过滤，水浴蒸干水分，然后将提取物用无菌水溶解，调整浓度至30 mg/mL，并用0.22 μm直径的细菌滤器过滤除菌后保存于-20℃条件下备用。 　　1.2.3 细胞毒试验 处于对数生长期的CEF和sp2/0细胞，分别转移至24孔细胞培养板中培养，调整细胞浓度，使各孔的细胞量为5×104。培养6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL复方中药的DMEM培养液替换原先的细胞培养液，每个药物浓度设置四个重复组，其中0 mg/mL为对照。细胞继续培养24 h后，1000 r/min离心5 min，收集细胞，PBS重悬细胞后，用台盼蓝染色进行活细胞计数。结果用占对照组活细胞的百分比表示。 　　1.2.4 细胞凋亡试验 为进一步确定该复方中药杀伤细胞的机制，使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒对细胞的凋亡情况进行检测。将处于对数生长期的CEF细胞，转移至6孔细胞培养板中培养，调整细胞浓度，使各孔的细胞量为5×105。培养6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL复方中药的DMEM培养液替换原先的细胞培养液，每个药物浓度设置三个重复组，其中0 mg/mL为对照。继续培养2 h后，1000 r/min离心5 min收集细胞，用1×binding buffer调整细胞浓度为1×106个/mL，用FITC标记的Annexin Ⅴ避光染色5 min，随后PI避光染色5 min，立即用流式细胞仪测定细胞凋亡情况。根据CEF的细胞凋亡率选取最适药物浓度，然后以此浓度的药物分别作用于sp2/0细胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h测定肿瘤细胞凋亡的动态变化。 　　1.2.5 小鼠同源肿瘤模型的建立及治疗 12只五周龄的雄性BALB/C