基于PCR―DGGE中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征.docVIP

基于PCR―DGGE中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征 　　摘要：为了解四川中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征，分离提取土壤微生物DNA，以细菌通用引物PCR扩增，DGGE分离，切割条带、回收并测序，在GenBank中查得菌种。结果表明，中江丹参轮作期间，土壤细菌主要群落包括：Alpha proteobacterium，Sphingomonas sp.，Uncultured bacterium isolate LH2-12，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band h，Uncultured Arthrobacter sp.，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band a1-11，Uncultured Sphingomonas sp.。休种1年与当年种植丹参土壤细菌多样性相似，而与休种3年土壤细菌种群结构有明显差异；休种第2年属于过渡。说明中江丹参轮作期休种为其土壤细菌群落遗传多样性逐渐恢复平衡过程；且休地第2年是关键时期，与笔者前期采用培养法及土壤真菌群落结构相关的研究结果一致。 　　关键词：丹参土壤细菌；PCR-DGGE；遗传多样性；变化特征 　　中图分类号：S567.5+30.1；S154.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）04-0048-04 　　收稿日期：2013-08-20 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；国家科技支撑计划（编号：2006BAI09B03-4）。 　　作者简介：林贵兵（1981―），男，四川自贡人，博士，讲师，研究方向为中药资源可持续利用与药材质量标准化。Tel：（0791E-mail：linguibing897@。 　　通信作者：严铸云，博士。E-mail：cdtcmyan@126.com。丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效。在中药材生产质量管理规范（GAP）实施过程中，中药材种植快速发展；但也出现了一些严重的问题，如连作障碍。丹参忌连作，连作导致病虫害严重，其质量和产量明显下降[1]。土壤生物环境恶化是引起作物连作障碍形成的主要机制之一[2]。研究结果表明，土壤微生物群落结构多样性与土传病害、连作障碍有着密切的关系[3]；对地黄[4]、麦冬[5]和苍术[6]研究认为，土壤微生物群落失衡是引起连作障碍的主要因素之一。在前期的研究中，通过纯培养法试验发现，种植丹参的土壤中各类微生物数量与群落结构发生变化，重新建立土壤生态系统平衡；栽培丹参后土壤微生物群落自然恢复间隔至少为2年[7]。前期的研究方法主要是通过培养法研究土壤微生物群落，但此法只能对土壤中的可培养优势微生物进行分析，而土壤中有绝大部分是不可培养微生物，因此培养法不能全面反映其微生物群落。本试验以PCR-DGGE技术研究中江丹参栽培轮作休地期间其土壤细菌群落遗传多样性变化特征，以揭示细菌群落结构在土壤微生物群落平衡自然恢复的变化特征，为丹参栽培地轮作期间土壤退化的修复以及缓解连作障碍提供理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1供试土壤基本情况 　　试验区设在四川中江石泉镇范围内，104°35′26″E，30°57′04″N，属中亚热带湿润气候区；年平均气温16.5 ℃，年均降雨量1 200～1 400 mm；地形为台地，地势较平坦，面积 1 km2，土壤属红黄壤，海拔750 m。 　　2008年3月在试验区范围内，选取丹参休种（现为油菜）1～4年的样地，长宽在20 m×10 m以上；每一休种年选5块样地，丹参休种期间，为油菜-小麦的轮作体系；采用双“S”法采样与四分法取1.0 kg土壤，用牛皮纸袋装好，带回实验室，在4 ℃下保存备用，1月内进行土壤微生物分析。 　　1.2土壤微生物的解离 　　取土壤样品2.0 g，加入20 g/L的偏磷酸钠（pH值8.5，含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30），涡旋振荡，离心，去上清液。 　　1.3土壤微生物DNA提取方法 　　参照文献[8-11]，略作改良，具体如下：（1）取沉淀于SDS裂解液中涡旋；（2）68 ℃温浴1 h，同时轻轻摇动，12 000 r/min 离心，取上清液体；（3）加入0.125倍体积的 5 mol/L 的醋酸钾和0.42倍的40%的 PEG-8000；在-20 ℃下沉淀约15 min，12 000 r/min离心15 min，去上清液；（4）加入CTAB 提取液中溶解沉淀，68 ℃温浴15 min，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻柔混均匀，12 000 r/min离心10 min；（5）在DN