糖基化工程1-附件.pptVIP

* 糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。糖基化工程是通过对蛋白质表面的糖链进行改造，对蛋白质的结构和功能有重要影响，从而改良蛋白质性质的一种技术。 糖基化工程 当基因工程和蛋白质工程药物的生产正如火如荼时，人们惊奇地发现，很多糖蛋白药物在不同细胞中表达所得的产物，其免疫原性、半衰期、生物活性等各不相同，原因就是糖基化的不同。如何使表达产物进行合适的糖基化这一问题的提出，促使了糖基化工程（glycosylation engineering）这一新领域的产生。糖基化工程的研究，主要集中于糖蛋白糖链功能的分析和糖基化表达体系的构建。如科学家将昆虫细胞改造后，可表达正确的糖链；日本Kirin公司则准备改造酵母。可以预见，糖基化工程研究在理论上可阐明糖链的功能，在实践上则可为解决基因工程药物的免疫原性、生物活性及药物设计等问题提供指导。 1、蛋白质的糖基化 糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。根据糖链和肤链的连接方式的不同，蛋白质的糖基化可分为N糖基化和O糖基化。 N-糖基化是通过糖链的还原端的N乙酰氨基葡萄糖(GLc-NAc)和肤链中某些Asn侧链酰胺基上的氮原子相连。能接有糖链的Asn必须处于Asn-X Ser/Thr 3残基构成的基序中，其中X可为除Pro的任意的氨基酸残基。 O糖基化的结构比N-糖基化简单，一般糖链较短，但是种类比N糖基化多得多。糖链中可以糖基化的主要是Ser和Thr，此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸，连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子。 1.1 N-糖链通常都有一个五糖核心 根据它们的外层链结构的不同，可分为：高甘露糖型(High mannose)，杂合型(Hybrid type)与复合型(CoMplex type)。三者之间的区别在于：高甘露糖型只含有多个α连接的甘露糖残基，而复杂型具有以盐藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）和唾液糖（SA）为组分的糖链天线，杂合型则兼由有两种特点。 高甘露糖型 杂合型 复杂型 1.2 O-糖基化 研究比较少， 首先，没有特征修饰序列可做修饰位点预测；o-糖基化的糖链结构比较复杂，至少存在4核心结构。尚未发现可以将0一糖链整体从肽链上游离的内切酶肤上游离需要采用其他的化学手段使o-糖链从多肽上游离。 1.3 糖的不均一性 Macroheterogeneity, also termed as variable site occupancy, refers to variability in the location and number of oligosaccharide attachments. On theother hand, microheterogeneity, also termed sitemicroheterogeneity,refers to the variability in the oligosaccharide structures at specificglycosylation sites. Macro- and microheterogeneity in glycosylation result in a set of glycoforms for one specific glycoprotein, all of them have an identical amino acid backbone but are dissimilar in the structure and/or the disposition of their carbohydrate units. This heterogeneity leads to different physical, biochemical and biopharmaceutical properties and, therefore, also functional diversity. CHO细胞表达细胞粘附分子 1.3 糖基的合成 糖蛋白到达Golgi体后，那些最终成为复合性结构的寡糖，通过N-已酰葡萄糖胺转移酶I添加N-已酰葡萄糖胺残基，由Golgi体内的α-甘露糖酶II切除两个甘露糖残基，随后由GlcNAc转移酶加入天线上的GlcNAc残基。同时，Fuc转运酶可能转运一个Fuc到糖链的GlcNAc上。复合型寡糖的合成最后步骤发生在Golgi体的反面囊腔中。此时Gal或SA转运酶催化添加Gal和SA。最后新合成的糖蛋白离开Golgi体，运送到最终目的地。最终的寡糖结构在很大程度上取决于糖蛋白在处理过程中与糖基化酶和糖基化转运酶的作用顺序，以及它们特异性作用，许多不同的酶催化不同的反应，最后形成最终的寡糖结构。