基于尿液代谢组学研究黄连和胆黄连对热证药效作用机制差异性お.docVIP

基于尿液代谢组学研究黄连和胆黄连对热证药效作用机制差异性お 　　[摘要]利用超高效液相色谱与LTQOrbitrapMS串联质谱仪的尿液代谢组学方法，研究黄连、胆黄连对热证模型大鼠药效作用机制的差异性，探讨胆黄连炮制的科学性。采用大鼠灌胃附子、干姜、肉桂水煎液1.5 d并皮下注射干酵母混悬液致热证模型，给药1.5 d后采集各组大鼠造模后0～6，6～1.2，1.2～2.4 h的尿样；采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLSDA）法等技术进行数据处理。正常组与模型组在0～6，6～1.2 h达到分离，1.2～2.4 h出现重叠，分离趋势不明显；黄连组和胆黄连组0～6 h大鼠尿样与模型组分离，接近于正常组；黄连组和胆黄连组在0～6，6～1.2 h大鼠尿样有分离趋势。鉴定30个与热证相关的差异代谢物，结果表明，黄连经猪胆汁炮制后对热证模型大鼠的整体药效作用发生改变，胆黄连解热作用具有多靶点、起效快、作用强度较强的特点，主要通过对胆碱能神经递质、氨基酸代谢、嘌呤代谢的调节发挥解热作用。 　　[关键词]黄连； 胆黄连； 热证； 尿液代谢组学 　　黄连味苦，性寒，具有泻火解毒、清热燥湿的功效，主要含有小檗碱、巴马汀、药根碱等生物碱类化学成分[1]。《本草纲目》对黄连的炮制方法记载详细，如治本脏之火，生用黄连；治肝胆实火，以猪胆汁浸炒黄连等。在制药论中，黄连经猪胆汁炮制后寒性增强，有“寒者益寒”、“从制”的炮制理论。目前，对黄连炮制品相关报道较多[23]，但在胆黄连炮制机制的研究方面尚缺少现代分析技术的研究。本文在前期研究的基础上，通过尿样代谢组学方法，以大鼠灌胃温里药并皮下注射干酵母造成热证的模型方法[4]，采用超高效液相色谱与离子肼串联高分辨质谱仪（UPLC/LTQOrbitrapMS）联用技术，分析大鼠尿液内源性代谢物的变化及代谢通路的不同，对黄连与胆黄连治疗热证的药效作用差异性进行深入研究，以期探讨黄连用猪胆汁炮制的科学内涵。 　　1材料 　　UPLC/LTQOrbitrapMS（Linear ion trap quadrupoleorbitrap hybrid mass spectrometer）高性能串联质谱仪，MassLynxV4.1工作站（美国Thermo Fisher）；MC3B电脑数字式体温计（欧姆龙大连有限公司）；CENCO型涡旋仪（荷兰Breda公司）；Biofuge Stratos型低温高速离心机（德国Heracus公司）；LABCONCO型冷冻干燥机（美国LABCONCO公司）。 　　黄连、干姜、肉桂、黑附子均购自于大连权健中药饮片有限公司，经辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎， 姜科植物姜Zingiber officinale Rose的干燥根茎，樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的干燥树皮，毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx 的子根；干酵母（安琪酵母有限公司）。 色谱级甲醇、乙腈购于Merck INC（Germany），甲酸（色谱级）购于Dikma technology INC （USA），超纯水由MilliQ system （USA） 制备。赖氨酸、乙酰胆碱、5甲基尿苷、胆碱、脯氨酸甜菜碱、DL高半胱氨酸、N乙酰基L组氨酸、N6乙酰基L赖氨酸、葫芦巴碱、5甲基胞苷、7甲基鸟嘌呤、2氨基丁酸、黄嘌呤、脱硫生物素、蛋氨酸、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、4乙酰氨基丁酸、泛酸、2呋喃甲酰基甘氨酸、3吲哚乳酸、3甲基L组氨酸、S腺苷甲硫氨酸、尿酸、尼克酰胺、酪氨酸、腺嘌呤、精氨酸、犬尿酸、核黄素均购自于Sigma公司。 　　Wistar大鼠，雌性，（200±20）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号SCXK（辽早晚各测定大鼠肛温1次，连测3 d，选取肛温在3.70～3.80 ℃，波动在05 ℃ 以内者纳入实验。 　　2方法 　　2.1胆黄连的制法及供试品溶液的制备 　　2.1.1胆黄连的制法取黄连饮片，加含1.5%猪胆汁的水溶液（每100 g黄连加40 mL）拌匀，闷润1 h，95 ℃下翻炒1.9 min，即得。 　　2.1.2供试品溶液的制备取胆黄连饮片称重，加10倍量水浸泡05 h，煎煮1 h，绢布滤过，药渣再加8倍量水煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩至相当于生药量01 g?mL-1。同法制成黄连供试品溶液。 　　2.2分组与给药 　　40只大鼠，随机分为4组，每组10只。Ⅰ组：正常组；Ⅱ组：热证模型组；Ⅲ组：黄连组；Ⅳ组：胆黄连组。每日8：00，Ⅰ组灌胃4 mL生理盐水，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组灌胃4 mL附子、干姜、肉桂的水煎液（1∶