基于碳纳米管修饰电极胆碱电化学发光生物传感器研制.docVIP

基于碳纳米管修饰电极胆碱电化学发光生物传感器研制 　　摘要 在碳纳米管（CNTs）和K3Fe（CN）6修饰的铂电极上吸附固定胆碱氧化酶，以鲁米诺为发光试剂，研制了胆碱电化学发光（ECL）生物传感器。CNTs可有效提高电极表面的电荷传输能力、提高电极表面的生物相容性和对酶分子的固载能力；K3Fe（CN）6对酶活性具有激活作用，同时对H2O2增敏的鲁米诺ECL有增强作用，均有利于提高传感器的检测灵敏度。研究表明，将CNTs分散液与K3Fe（CN）6混合，滴涂修饰在Pt电极上，吸附固定胆碱氧化酶，制备传感器。此传感器在含有8×10－6mol/L鲁米诺的磷酸盐缓冲液（pH7.4）、30 ℃条件下产生的ECL强度与胆碱浓度在1×10－7～4×10－3mol/L范围内呈线性关系，相关系数为0.994，检出限为1.2SymboltB@ 10－8 mol/L。此生物传感器应用于鼠血样中胆碱的测定，测得结果为2.68 mg/L，平均回收率为101.1%。传感器具有快速、稳定和重现性好等特点，有望应用于常规分析。 　　关键词 电化学发光；生物传感器；鲁米诺；胆碱；碳纳米管 　　2011-03-08收稿；2011-05-25接受 　　本文系国家自然科学基金（Nos.20675055）资助 　　* E-mail：tuyf@suda.edu.cn1 引言 　　电化学发光（ECL）分析法由于其可控性好、灵敏度高、选择性好、仪器简单等优点已成功应用于环境科学、生命科学和材料科学等领域。鲁米诺是常用的发光试剂，它具备很好的发光性能，尤其是对活性氧有良好的响应，可作为酶催化反应的信号输出，以研制ECL生物传感器［1～3］。诸多酶催化反应的产物为H2O2，可以通过H2O2对鲁米诺ECL的增敏作用实现生物传感，将ECL的高灵敏度与酶反应的高选择性结合，具有极好的应用前景。 　　胆碱是中枢神经系统重要的神经递质乙酰胆碱的前体［4］，在临床检验中，它被用作为如帕金森氏症和阿尔茨海默氏病脑组织胆碱功能活性的标志物［5～7］。胆碱缺乏被认为可能是这些疾病诱因之一，目前胆碱也被列为安全的食品添加剂。测定胆碱常用方法有生物测定方法、氢火焰气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱法等［8］。近年来开发了多种分析胆碱的生物传感器，Hsieh等［9］利用几丁质，将胆碱氧化酶（ChOx）共价固定于铂电极表面，用于分析胆碱浓度，检出限为10.0 SymbolmA@ mol/L， Garguilo等［10］制备了选择性监测大鼠脑胞外微摩尔浓度胆碱的微型安培传感器。固定ChOx的方法有多种，是影响其催化活性及稳定性和灵敏度的因素［11］。ChOx可通过聚乙烯醇低温凝胶膜［12］、含普鲁士蓝的碳糊［13］及辣根过氧化物酶，共同固定于透析膜支撑的碳糊［14］等方式固定于电极表面。碳纳米管（CNTs） ［15］由于其高导电性、强吸附性、良好的机械强度和优良的生物相容性，已成功应用于生物分子的组装［16］。 　　本研究报道了基于碳纳米管修饰电极和鲁米诺ECL的胆碱生物传感器，其酶催化反应可描述为［17］： 　　Choline＋O2Betaine aldehyde＋H2O（1） 　　 　　作为一种有效的ECL增强剂［18］，酶催化反应所产生的H2O2增强了鲁米诺的ECL强度。基于此原理，本研究组研制了测定乳酸［19］、谷丙转氨酶［20］和尿酸［21］的ECL生物传感器。在这些研究中，分别对CNTs和K3Fe（CN）6在ECL生物传感器中的重要作用进行了探讨，CNTs有效提高了电极表面的生物相容性和电荷传输能力，提高了电极表面对酶及其它化学分子的固载能力；K3Fe（CN）6则不仅对酶的活性有很强的激活作用，同时对H2O2增敏的鲁米诺的ECL具有增强作用［22］，有利于提高所研制生物传感器的检测灵敏度。与文献［23］报道的胆碱生物传感器的线性下限5×10－7mol/L比较，本研究中的胆碱ECL生物传感器的定量下限和检出限分别为1×10－7mol/L 和1.21SymboltB@ 10－8mol/L，表明本传感器具有更好的灵敏度。人血清中胆碱的生理浓度约为6～7 SymbolmA@ mol/L（约0.7 mg/L）［24］，本传感器可望应用于此类样品的实际检测。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　由外部脉冲发生器提供信号的BAS-100A电化学分析仪（Bioanalytical System Inc.公司）作为电化学发光研究的脉冲恒电位源，三电极系统的工作电极和辅助电极均为铂电极，Ag/AgCl电极为参比电极，所使用的电解脉冲为上限电位0.8 V、下限电位－0.3 V，周期2 s、占空比1∶10。实验室研制的以光电倍增管为感光元件的PMT-II型