GB/T 17999.5-1999SPF鸡　酶联免疫吸附试验.pdf

GB/T17999.5-1999 前 言 酶联免疫吸附试验(ELISA)是国外监测SPF鸡淋巴白血病病毒感染的通用方法。我国建立的淋巴 白血病ELISA方法敏感性高、特异性强、重复性好，已广泛用于商品种鸡场淋巴白血病的净化和SPF 鸡场淋巴白血病病毒感染的监测，本标准在此基础上，规定了SPF鸡酶联免疫吸附试验。 SPFA鸟微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检 测方法。本标准为(((SPF鸡 酶联免疫吸附试验》。 SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分: GB/T17999.1--1999SPF鸡 红细胞凝集抑制试验; GB/T17999.2-1999SPF鸡 血清中和试验; GB/T17999.3-1999SPF鸡 血清平板凝集试验; GB/T17999.4-1999 SPF鸡 琼脂扩散试验; GB/T17999.6一1999 SPF鸡 胚敏感试验; GB/T17999.7-1999SPF鸡 鸡白痢沙门氏菌检验; GB/T17999.8-1999SPF鸡 试管凝集试验; GB/T17999.9-1999SPF鸡 间接免疫荧光试验。 本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。 本标准由农业部畜牧兽医司归口。 本标准起草单位:农业部实验动物研究中心。 本标准主要起草人:陈德威、张冰、赵立红、黄进、李军。 中华人民共和国国家标准 GB/T 17999.5一1999 SPF鸡 酶联免疫吸附试验 SPFchicken--Enzyme-linkedimmunosorbentassay 1 范围 本标准规定了酶联免疫吸附试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。 本标准适用于SPF鸡感染淋巴白血病病毒后的群特异性抗原的监测。 2 原理 检测SPF鸡蛋清中禽白血病病毒主要群特异性抗原P27的方法为双抗体夹心酶联免疫吸附试验。 先用抗P27抗体包被酶标板，然后与蛋清作用，蛋清中的P27与包被抗体结合，洗去未结合的物质。再 加入HRP兔杭P27抗体，作用后洗去未结合的酶标物 加入底物溶液，出现颜色变化。颜色变化的速度 及程度与样品中P27的含量有关 3 试剂和器材 3.1 试剂 3-1门 包被抗体(兔抗P27 IgG), 11.2 RH性抗原(P27)。 3门.3 阴性抗原。 3.1.4 被检蛋清。 3.1.5HRP-兔杭P27o 3.1.6 包被液: 。.05mot/IpH9.6碳酸盐缓冲液配制碳酸钠1.59g,碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1000MI 3.1.7 洗涤液: pH7.4,PBS-TWeen20配制,0.01m0I/I_,PH7.4PBS1000mL，吐温-20。.3MI 3,1.8 底物溶液: pH5.。磷酸盐一柠檬酸缓冲液一OPD-H,O,配制 。.2mol/I磷酸氢二钠溶液25.7mI0.1mot/I 柠檬酸溶液24.3ml，蒸馏水50MI，邻苯二胺(OPD)40mg,30%H,0,0.15ml I，.9 终止液:2mol/I硫酸。 3.2 器材 3.2.1 酶标板。 3.2.2 移液器。 12.3 恒温培养箱。 3.2.4 FIASA读数仪 4 操作程序 4.1抗体包被 用包被液将免杭P271gG作适当稀释，每孔100pL,4C过夜。 国家质量技术监督局1999一11一，0批准 2000一04一01实施 GB/r17999.5一1999 4.2洗涤:甩去包被液，每孔加满洗涤液(约300pi)，静置3min，甩干，如此重复3次 4.3加样:每孔加100pI被检蛋清，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，37C作用60min 甩去样 品，洗涤同上。 4.4 侮孔加HRP一免抗P27(工作浓度)100pL,37C作用45min-60min，甩去HRP一兔抗P27液，洗 涤同 卜 4.5 加底物溶液:每孔加100kL新配制的底物溶液，避光作用15min 4.6终止反应:每孔加终