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塞来昔布联合放疗对人胆管癌细胞凋亡作用研究 　　[摘要] 目的 研究人胆管癌细胞在塞来昔布和放疗作用下发生凋亡的作用机制。 方法 将QBC939细胞株分为四组：对照组、塞来昔布组（C组）、放疗组（R组）和塞来昔布联合放疗组（C+R组，联合组），分别进行不同浓度的塞来昔布和不同剂量X线作用后，采用CCK-8法、流式细胞技术和Western blot等方法分别检测各组细胞生长、凋亡率及survivin蛋白的表达。 结果 联合组的凋亡率明显增加，从3.527%升至23.364%（P0.05），survivin蛋白表达明显降低（P0.05）。 结论 应用塞来昔布对接受放疗的人QBC939细胞株有凋亡增敏作用，下调survivin的表达是其机制之一。 　　[关键词] 塞来昔布；胆管细胞癌；放疗；survivin基因 　　[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）10-0019-03 　　胆管细胞癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，因其解剖位置特殊，早期诊断较困难，可手术切除的患者不到20%，放化疗是中晚期患者主要治疗手段，但放疗效果受到肿瘤敏感性的限制。塞来昔布作为一种COX-2抑制剂，在近年研究中被认为具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[1，2]。本研究探讨体外条件下塞来昔布对接受X线放疗的人QBC939细胞凋亡的作用及可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料及细胞培养 　　QBC939人胆管癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，塞来昔布购自南京德宝生化有限公司，细胞培养基为含10%胎牛血清的1640培养基，兔抗人survivin多克隆抗体及β-actin购自Santa-Cruz公司，CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技研究所。细胞培养条件：37℃、5%CO2的培养箱。实验设计及研究时间2012年1月～2013年1月。 　　1.2 CCK-8法检测细胞生长 　　取传代培养的对数生长期QBC，939细胞制成1×105个/L细胞悬液，种植在96孔板中，每孔100 μL。设为调零组（不含细胞的培养液），对照组（常规培养细胞，不接受塞来昔布及放疗），实验组（分别加入浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L的塞来昔布，X线放疗剂量分别为2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy），实验组每组设10个复孔。培养48 h后实验组每孔加CCK-8试剂10 μL，再培养2 h后，用酶标仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度，计算细胞增殖抑制率，并进一步计算出塞来昔布的IC50=64.2 μmol/L。在后续实验中选择浓度65 μmol/L塞来昔布。X线放疗的IC50为5.83 Gy，选择剂量6 Gy用于后续实验。抑制率=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。 　　1.3 流式细胞术检测 　　将实验分为四组，每组样本数为10，分组设置如下：对照组单纯培养细胞；塞来昔布组（C组）加入浓度65 μmol/L塞来昔布；放疗组（R组）给予剂量6 Gy X线照射；塞来昔布联合放疗组（C+R组）先给予浓度65 μmol/L塞来昔布24 h后更换培养液，再给予剂量6 Gy的X线照射细胞，各组细胞均培养48 h，收集细胞并离心，按试剂盒说明书进行检测，凋亡细胞的比例由Cell Quest Pro 软件计算，实验重复3次。 　　1.4 Western blot蛋白检测 　　收集上述各组细胞，每组样本数为10，加入细胞裂解液，提取总蛋白，调整各组总蛋白，使各组总蛋白浓度相同。经15%SDS电泳后电转移至PVDF膜，封闭后加入一抗（兔抗人survivin多克隆抗体），工作浓度为1∶1000，再加入二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体），工作浓度为1∶6000。同样方法进行内参蛋白（β-actin）的抗体孵育。发光、显影、定影后制成胶片，扫描后用凝胶图像处理体统分析目标条带的净光密度值。 　　1.5 统计学分析 　　采用SPSS18.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 细胞的凋亡率 　　如图1所示每组细胞的流式图，结果显示联合组的凋亡率明显高于对照组、塞来昔布组及放疗组（P0.05，见表1）。结合图1及表1结果，推断塞来昔布对QBC939的X线放疗有增敏作用。 　　2.2 Survivin蛋白的表达 　　联合组survivin蛋白表达较其他各组要明显减弱（图2），用相关软件计算出各条带的灰度值，将目的蛋白survivin/β-actin灰