大白菜PHK4基因cDNA3′端序列克隆及分析.docVIP

大白菜PHK4基因cDNA3′端序列克隆及分析 　　摘要采用3′RACEcDNA末端扩增技术，克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp，其中编码区序列546bp，编码181个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AHK4基因的同源性分别为90%和96%，说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高，而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52%，远低于编码区。 　　关键词　大白菜；PHK4基因；3′RACE；克隆 　　中图分类号Q785　文献标识码A　文章编号1007-5739（2009）01-0007-02 　　 　　植物在生长发育过程中有多种复杂的信号系统来识别并应答外界环境刺激，蛋白磷酸化和去磷酸化是调节细胞内信号转导的最重要的机制，这一过程由蛋白激酶催化。根据磷酸化依赖底物的特异性不同，可将蛋白激酶分为：丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和组氨酸激酶[1，2]。典型的双组分信号系统是由组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白组成，当组氨酸激酶以某种方式感应到环境刺激后，其组氨酸残基自身磷酸化，并将磷酸基团转移到反应调节蛋白的天冬氨酸残基上，进而引起下游的信号级联反应来适应环境变化[3，4]。 　　 　　细胞分裂素的信号转导是通过双组分信号系统进行的。在拟南芥中，该信号系统由感受细胞分裂素的杂合型组氨酸激酶型受体、磷酸转移蛋白和应答调控蛋白组成[4]。目前已确认的拟南芥中的细胞分裂素受体有3个：AHK2、AHK3和AHK4，其中AHK4主要在根中表达，该基因突变后，植株会失去细胞分裂素对根伸长的抑制作用[5，6]，从而影响植物的正常生长。 　　大白菜因其营养丰富、种植简便、产量高等特点，成为广泛栽培且受人们喜爱的蔬菜之一。为了研究大白菜中细胞分裂素的信号转导途径的特点，笔者拟首先扩增出大白菜中与AHK4基因同源的细胞分裂素受体基因PHK4 （Pekinensis Histidine Kinase 4）的cDNA序列。RACE技术即快速cDNA末端扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE），它利用PCR技术，由已知的cDNA序列扩增出完整、真实的cDNA5′和3′末端序列，该方法也被称为锚定PCR或单边PCR[7]。目前，RACE技术正逐步取代经典的cDNA文库筛选技术，已成为获得全长cDNA序列的一种重要手段[8]。本研究以本课题组从大白菜中克隆得到的一段PHK4基因的cDNA序列为基础，利用3′RACE技术对该基因3′端未知序列进行扩增，获得了大白菜PHK4基因的3′端真实序列，从而为进一步研究该基因的功能和应用奠定基础。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1供试材料 　　1.1.1材料。大白菜AB-81。 　　1.1.2试剂。Trizol试剂购自上海英骏生物技术有限公司；dNTP Mixture，PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，RNArase Inhibitor，琼脂糖凝胶回收试剂盒，pMD19-T载体均购自TaKaRa公司。 　　1.1.3引物设计。参照AMBION公司的RACE试剂盒说明书，合成3′RACE Adaptor. Adaptor1和Adaptor2（见表1）；根据大白菜一段PHK4基因的cDNA序列设计特异性引物SP1和SP2，所有引物均在上海英骏生物技术有限公司合成。 　　 　　1.2试验方法 　　1.2.1总RNA的提取。利用Trizol试剂一步法提取大白菜总RNA[9]。 　　1.2.2反转录合成cDNA。在200μLPCR管中加入大白菜RNA 6μL（50ng），3′RACE Adaptor 2μL（20μM），dNTP Mixture（10mM）1μL，加RNase Free H2O至10μL，混匀后70℃保温15min，迅速在冰上冷却2min；加5×Prime ScriptTM Buffer 4μL、RNArase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Prime ScriptTM Reverse Tran scriptase（200U/μL）0.5μL，加RNase Free H2O至20μL，混匀后42℃保温1h；70℃处理15min，冰上冷却，得到大白菜cDNA。 　　 　　1.2.33′RACE扩增。按照AMBION RACE cDNA Ampli-fica tion Kit说明书操作步骤进行。先以Adaptor1和SP1为引物，进行第1轮PCR反应；再以Adaptor2和SP2为引物，进行第2轮PCR反应。 　　1.2.4PCR产物回收和测序。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，连接到pMD19-