大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡影响.docVIP

大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡影响 　　【摘要】目的 探讨大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 体外培养的K562细胞，用不同浓度大蒜素处理24、48、72h，MTT法测定其对K562细胞增殖的影响；大蒜素（浓度分别为3、6、12μg/mL）处理K562细胞48h后，分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、Rh123探针染色流式细胞仪检测线粒体膜电位变化、分光光度计检测Casepase-3、Casepase-9相对活性、western blot法检测环氧合酶2（COX-2）表达情况。结果 大蒜素（浓度2~32 μg/mL）能抑制K562细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性；大蒜素（浓度分别为3、6、12 μg/mL）作用K562细胞48 h后，细胞凋亡率分别为11.5%、21.4%、36.6%，对照组凋亡率为2.2%；Casepase-3、Casepase-9相对活性显著增加；COX-2的表达降低，呈剂量依赖性。结论 大蒜素能抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与下调COX-2基因的表达、增加细胞Casepase-3、Casepase-9活性及降低线粒体膜电位有关。大蒜素是一种前景广阔的抗肿瘤药物。 　　【关键词】大蒜素；K562细胞；Caspase-3；Caspase-9；环氧合酶-2 　　【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0141-01 　　 　　大蒜素（Allicin）是大蒜中最重要的有效成分，其具有广泛的生物学作用，包括抗菌、抗炎、抗血栓、降血压、降血脂、降血糖、调节免疫力等。流行病学表明，大蒜素的摄入能减少多种肿瘤的发生［1］；动物和细胞实验研究证实，大蒜素在体内外对多种肿瘤包括皮肤癌、肺癌、肝癌、结肠癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等均有抗肿瘤作用［2］。为探讨大蒜素对血液系统肿瘤的的影响及其机制，本研究以人白血病细胞系K562细胞为对象，观察大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖、凋亡的影响，并检测大蒜素对K562细胞线粒体膜电位、Caspase-3、Caspase-9活性变化及western blot检测环氧合酶-2（COX-2）蛋白表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 人白血病细胞系K562细胞购自中国科学院上海细胞库；大蒜素注射液购于山西普德药业股份有限公司（30 mg/支）；MTT、罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）购于sigma公司；IMDM培养液、胎牛血清系GIBCO产品；AnnexinV /PI试剂盒、Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；COX-2单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根酶标记鼠抗山羊IgG购自武汉博士德生物科技有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 K562细胞培养于IMDM培养液中（10％小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素），置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱内培养，根据生长情况3~5 d传代一次。 　　1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的K562细胞，以1×104/ml的浓度、每孔200 μl接种于96孔板，待细胞贴壁后分为实验组和对照组，实验组分别加入大蒜素终浓度为2、4、8、16、32 μg/mL的培养液，对照组加入等量的培养液，并设立调零孔。每组设5个复孔，分别培养24、48、72 h，实验结束前4 h每孔加入加入20 μl MTT试剂，培养箱中继续孵育4 h，然后小心吸掉上清，每孔加150 μl DMSO，摇床上振荡10min使结晶充分溶解，酶标仪检测570 nm处的吸光值（A值），抑制率=［1-(实验组平均A值-调零孔A值)/(对照组平均A值-调零孔A值)］×100%。 　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，以1×106/ml浓度接种于6孔培养板中，贴壁后分为实验组和对照组，实验组分别加入大蒜素终浓度分别为3、6、12 μg/mL的培养液，对照组加入等量培养液，培养48 h后，收集细胞，离洗固定后加入AnnexinV-FITC 和PI染色。筛网过滤送流式细胞仪检测细胞凋亡率。 　　1.2.4分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9活性变化 细胞接种及分组同上，培养48 h后，收集细胞，分别加入50 μl冷裂解缓冲液，冰浴裂解15 min，然后4 ℃，1200r/min离心15 min，将上清移至预冷的离心管中，置于冰上，取5 μl用BCA法测定蛋白浓度，取50 μl调好蛋白浓度（2~4 g/L），加入20 μl反应缓冲液吹打均匀，