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姬松茸ISSR特异扩增体系研究 　　摘要：为了建立稳定的姬松茸 (Agaricus blazei Murill) 简单序列重复区间（Inter??Simple Sequence Repeats, ISSR) 分子标记技术体系，笔者通过单因子试验分别研究了模板DNA、Mg2+浓度、dNTP、引物浓度和Taq酶用量对姬松茸ISSR??PCR扩增的影响，确定了姬松茸ISSR分析的最佳PCR条件为：25 μL反应体系中，模板DNA 20 ng，引物0.75 μmol/L，dNTP 200 μmol/L，Mg2+ 2.0 mmol/L，Taq DNA polymerase 1.5 U。并应用该优化体系筛选到6个适合姬松茸ISSR??PCR扩增的引物，为利用ISSR标记技术研究姬松茸的种质资源提供了参考。?? 　　关键词：姬松茸；?A简单序列重复区间；?A体系优化；?A单因子试验?? 　　中图分类号：646.110.1?ξ南妆晔堵耄?A 　　 　　姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又名小松菇、柏氏蘑菇、巴西蘑菇，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricus)、蘑菇科(Agaricaceae)、蘑菇属(Agaricus)，原产于巴西，是一种珍稀食药两用菌[1]，深受美国、日本、巴西等国消费者的青睐。我国生产的姬松茸主要用于出口。由于受菌种质量的影响，优质、安全的姬松茸产品非常有限。因此，利用分子生物学技术研究姬松茸种质资源的遗传关系是进一步加强姬松茸优良品种选育的基础，也是保持食用菌产业可持续发展的需要。但是，在分子生物学技术飞速发展的今天，该技术在珍稀食药用菌姬松茸研究上的应用却很少，很大程度上只处于分子水平上现象的观察、数据的收集等较浅的层面。因此，姬松茸遗传育种、种质资源多样性研究仍未取得实质性的突破。?? 　　简单序列重复区间（Inter??Simple Sequence Repeats，ISSR）分子标记是ZIETKIEWIC[2]等以简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）技术[3]为基础发展起来的一种新的简单序列重复区间扩增多态性分子标记。ISSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，能比RAPD、RFLP更快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的稳定性和多态性 [4,5]，且操作简单，所需DNA量少，无需预知研究对象的基因组序列等优点，已经被广泛应用于植物的品种鉴定、遗传作图和遗传多样性等方面的研究[6??9]。在真菌的遗传研究中也得到了广泛的应用[10??12]。而姬松茸ISSR??PCR反应系统的建立及其群体遗传多态性的分析尚未见报道。鉴于 ISSR??PCR反应系统的各个因素及水平对反应结果均有影响，因此，笔者利用单因子试验对姬松茸ISSR??PCR反应体系 (25 μL) 的5个因素 (模板 DNA，Mg2+，dNTP，引物浓度，Taq 酶用量) 进行优化，确立了重复性好、结果清晰稳定的姬松茸ISSR??PCR试验参数，为深入研究姬松茸种质资源多样性奠定了良好的基础。?? 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1??供试菌株 　　本研究共选用了10个姬松茸菌株。姬松茸菌株AbML2、AbMD3、AbML7、AbM9和AbML11为福建省农科院土壤肥料研究所保存菌株；AbM2q 、AbM8q和 AbM±购自福建省轻工业研究所；AbM4s 购自三明市真菌研究所；AbMA购自福建省农科院工程研究所。其中，AbM9为出发菌株(引自日本)，AbML2、AbML7和AbML11为AbM9经离子束注入诱变所得菌株；AbMD3 为AbM9单孢分离菌株。本试验优化反应体系所用姬松茸菌株为AbM9，验证优化反应条件所用菌株为上述10个菌株。?? 　　林新坚，等：姬松茸ISSR特异扩增体系的研究 　　1.2?χ饕?试剂和引物 　　Taq酶、dNTP、MgCl??2、10×buffer等PCR扩增所用试剂及DNA Marker (Gene RulerTM100bp Ladder Plus)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；ISSR引物由大连宝生物 (TAKARA) 公司合成（表1）。 　　 　　1.3??基因组DNA的提取 　　采用改进后的氯化苄法[13]提取基因组DNA。经一定量的核酸酶 (RNase)纯化后，用美国UV??2800AH型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）定量测定波长260 nm和280 nm处的吸光度值。根据OD??260计算DNA的浓度，根据OD??260∶OD??280的值估算DNA的纯度[14]。用无菌ddH??2O稀释至所需浓度后，4 ℃保存备用。??