生物化学--蛋白质的一级结构.ppt

第三节 蛋白质的一级结构 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的?-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的?-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 各肽链共价主键相同，侧链不同 肽键 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。 四肽的结构 二、肽的物理和化学性质 短肽晶体的熔点很高，说明短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。 肽的酸碱性质决定于游离末端的氨基和羧基以及侧链基团上的可解离基团。 根据Handerson-Hasselbalch方程： pH=pK’+ lg[质子受体]/[质子供体] 当溶液pH大于解离侧链的pK’值，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的pH小于解离侧链的pK’值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸 净电荷为零时的溶液pH就是该肽的等电点 pI=(4.5+7.8)/2=6.15 肽的氨基末端的氨基酸残基可与茚三酮发生定量反应。 双缩脲反应：肽和蛋白质特有 短肽的旋光度约等于各氨基酸的旋光度的总和。长肽或蛋白质的旋光度不等于各氨基酸的简单加和 三、 天然存在的活性肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。 ? L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val ? ? L-Orn L-Orn ? ? L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu ? 短杆菌肽S(环十肽) ?由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。 四、 蛋白质的一级结构测定 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目. 多肽链的氨基酸顺序， 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 测定蛋白质的一级结构的要求 1，样品必需纯（97%以上）； 2，知道蛋白质的分子量； 3，知道蛋白质由几个亚基组成； 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 测定步骤 (1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。 根据蛋白质末端残基的摩尔数和蛋白质的分子量可以确定蛋白质分子中的多肽链数目。 （2）多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 （3）测定多肽链的氨基酸组成 完全水解后测定氨基酸组成，计算出氨基酸成分的分子比。 测定步骤 （4）分析多肽链N端和C端残基。 建立两个重要的氨基酸顺序参考点 （5）断裂多肽链内的二硫键。 （6）多肽链断裂成肽段。 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链样品降解成几套肽段，并将这些肽段分离开来。 （7）测定各个肽段的氨基酸次序 Edman降解法、酶解法、色质联用 测定步骤 （8）确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或几套肽段的氨基酸顺序彼此间又交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 （9）确定原多肽链中的二硫键位置。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 在碱性条件下，丹磺酰氯（二