南农生物分离程生物分离3.ppt

沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 沉淀法操作简便，成本低廉，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等也可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史。 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； C、对许多生物活性物质具有稳定作用 D、操作简单、安全。 缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难 盐析法 Cohnx经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度； β值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小； Ks为盐析常数，与蛋白、盐种类有关，与温度和pH值无关。 例题： 牛血清白蛋白的盐析：由实验测得牛血清白蛋白在2.5 mol/L和3.5 mol/L （NH4）2SO4溶液中的溶解度分别为12g/L和0.006g/L，则它在3.0 mol/L （NH4）2SO4溶液中的溶解度为多少？ 解：先由实验结果求得盐析常数： Lg[蛋白质的溶解度]=9.329-3.3[（NH4）2SO4] 因此，在3.0 mol/L （NH4）2SO4溶液中, [蛋白质的溶解度]=0.27g/L 盐析法 方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。 B、“β”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。 C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。 常用的中性盐中最重要的是（NH4)2SO4 ， 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也常在低温下（0～4℃）进行。 ? 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ? ? 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓 度 的（NH4)2SO4保存可达数年之久。 价格便宜。 (NH4)2SO4缺点： 水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，终产物必须除尽。 次常用Na2SO4 缺点：在40℃以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。 盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，避免局部硫酸铵浓度过大而造成蛋白质沉淀。 盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常