Wnt信号通路介导毛囊干细胞双向分化的分子调控机制的初步研究-外科学专业论文.docxVIP

广州医学院硕士学位论文Wn 广州医学院硕士学位论文 Wnt 信号通路介导毛囊干细胞双向分化的分子调控机制的初步研究 PAGE PAGE 2 Wnt 信号通路介导毛囊干细胞双向分化的分子 调控机制的初步研究 中文摘要 背景与研究目的 毛囊干细胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)的发现及体 外培养，为研制新型组织工程皮肤治疗在临床上烧伤创伤导致的皮肤缺损，提供 了新的思路和方法。目前研究认为 HFSCs 定位于毛囊外根鞘的隆突区，大致是毛 囊外根鞘最外层靠近立毛肌附着点处。HFSCs 是具有多向分化潜能、自我复制、 高度增殖能力等特点的多能干细胞，并且是分化为特定类型如表皮、毛囊和皮脂 腺等的细胞来源。在维持毛囊周期以及组织形成过程中，HFSCs 发挥重要作用。 毛囊周期处于静息状态时，细胞呈慢周期性；在外来信号刺激下，则表现出很强 的增殖潜能力和克隆形成能力，是上皮各类干细胞中最具增殖潜力的干细胞库。 本课题探讨中采用酶消化法得到完整的毛囊，根据毛囊形态特征和解剖结构，在 体外显微分离毛囊隆突区，成功地获得高纯度、有活性的人 HFSCs，进行细胞原 代和传代培养，为深入研究 HFSCs 生理功能及调节分化机制奠定了基础。 研究表明，HFSCs 的增殖分化受到自身基因及外来信号的共同作用。Wnt/β -catenin 信号通路在毛囊毛发发育中起重要作用。在胚胎发育和肿瘤发生中， Wnt 蛋白与相应受体结合将启动该信号途径，引起β-catenin 在胞浆内的堆积， 随之转入到细胞核中，并与 LEFl 结合激活下游靶基因，促进毛囊干细胞定向分 化。其他因素如化学物质(氯化锂等)、细胞生长因子等众多因素能使 HFSCs 胞浆 内β-catenin 水平改变，使 HFSCs 向着不同方向分化，但具体机制有待进一步 研究。本课题探讨以角质细胞生长因子(KGF)及氯化锂(LiCl)干预下，Wnt/β -catenin 信号通路在人 HFSCs 向毛囊乳突细胞或表皮细胞定向分化中的作用及 与其他信号因子的相互关系,以及药物控释系统在组织工程皮肤中的应用。本实 验从以下几个方面开展研究： 方法 1.采用酶消化法和显微分离法获取毛囊隆突区干细胞，进行原代培养。并以 1x103/ml、1x104/ml、1x105/ml 及 1x106/ml 接种密度体外培养人 HFSCs，观察细 胞生长情况，用 Hoechst 方法检测其生长曲线，观察各密度培养的 HFSCs 在不同 时间点的增殖效应；使用免疫荧光染色法对毛囊干细胞及其分化细胞进行鉴定。 筛选出体外最佳的 HFSCs 传代培养密度。 2.分别选用以 0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、10mmol/L、25mmol/L 的氯 化锂（LiCl）以及 0ug/L、10ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L 浓度梯度的角质 细胞生长因子（KGF）诱导毛囊干细胞分化,Hoechst 方法检测对比分析各组对细 胞增殖效应；探索促 HFSCs 分化的最佳 LiCl 及 KGF 浓度。使用 RT-PCR 检测对照 组、10mmol/ml LiCl 组和 10ug/L KGF 组干预后 3d、5d、7d、9d 细胞的β-catenin、 APC、GSK-3β、Axin 和 LEF1 的 mRNA 水平,观察转录水平情况，探讨 LiCl 和 KGF 诱导 HFSCs 分化过程中，不同时间点的 Wnt/β-catenin 信号途径及其相关信号 因子的表达和相互作用。 3.PLGA 纳米微球在组织工程皮肤构建的实验研究：制备 PLGA 纳米微球， 以扩增培养 HFSCs 为种子细胞，以载荷 LiCl-PLGA 及 KGF-PLGA 的脱细胞真 皮（ADM）为支架材料，体外形成组织工程细胞皮片。对该膜片进行细胞活性 染色及扫描电镜观察，评价该组织工程皮片，为动物实验奠定良好基础。 结果: 1.从人头皮成功分离培养出 HFSCs，在体外经多次传代后仍具有很强的增殖 能力和多向分化潜能，当 HFSCs 接种密度为 1x105ml 时，细胞增殖速度最快，扩 展能力强； 2.随 LiCl 浓度升高，细胞增殖效应减弱，而 KGF 随浓度增高增殖能力增强。 含有 LiCl 的 K-SFM 条件培养基中 HFSCs 形态改变明显，各组间有明显差别， LiCl10mmol/L 时分化比例高；而含有 KGF 的 K-SFM 条件培养基中 HFSCs 向表皮 细胞分化，β-catenin 变化不明显。实验发现，LiCl 在促 HFSCs 分化中，激活 Wnt/β-catenin 信号通路，抑制降解复合物重要成分 GSK-3β的表达下降，促使 β-catenin