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实验八 化学因素对微生物的影响 一、目的要求 1．了解常用化学药品对微生物的作用。 2．学习测定石炭酸系数的方法。 二、基本原理 重金属离子可与菌体蛋白质结合使之变性或与某些蛋白的巯基结合而使酶失活，重金属盐则是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生螯合作用而使其变为无效化合物； 有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，也可以破坏细胞膜透性使内含物外溢； 碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反应产生的强氧化剂也有杀菌作用； 为了比较各种化学消毒剂的杀菌能力，常以石炭酸为标准，即将某一消毒剂作不同稀释后，在一定条件下，一定时间内致死全部供试微生物的最高稀释浓度，与达到同样效果的石炭酸的最高稀释度的比值，称为这种消毒剂对该种微生物的石炭酸系数（酚系数）。石炭酸系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。 三、器材 1、菌种：大肠杆菌,金黄色葡萄球菌； 2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,牛肉膏蛋白胨液体培养基. 3、溶液或试剂：2.5%碘酒、0.1%升汞、5%石炭酸、75%乙醇,100%乙醇,1%来苏尔,0.25%新洁尔灭,0.005%龙胆紫，0.05%龙胆紫，无菌水生理盐水。 4、仪器或其他用具：无菌培养皿，无菌滤纸片、试管、吸管、三角涂棒、涂布器、镊子、移液枪等。 四、操作步骤 1．滤纸片法测定化学消毒剂的杀菌作用 (1)将已灭菌并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。 (2)用无菌吸管吸取0.2ml培养18小时的金黄色葡萄球菌菌液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。 (3)将已涂布好的平板底皿划分成4～6等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。 (4)用无菌镊子将已灭菌的小圆形滤纸片（D5mm）分别浸入装有各种消毒溶液的试管中浸湿。注意取出滤纸片时保证过滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致，并在试管内壁沥去多余药液。无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。 (5)将上述贴好滤纸片的含菌平皿，倒置于37℃温室中培养24小时后，取出测定抑菌圈大小，并说明其杀菌强弱。 2．石炭酸系数的测定 　（1）将5％（1：20）的石炭酸液按表Ⅸ-1配成不同浓度，每管5ml。 　（2）将待测药物（来苏尔）先配成1：20的原液，再按表Ⅸ-2配成不同浓度，每管 5ml。 　 （3）取肉膏蛋白胨液体培养基30管，1～15管标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理，16～30管标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理。 （4）在上述不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液中，各接入0．5ml大肠杆菌液，摇匀。注意每管自接种时起在5、10、15分钟，用同一接种环从各管内取一环接入上述已标记的液体培养基试管中。 （5）置37℃温室中培养 48小时，观察并记录生长情况。生长者溶液混浊，以“+”表示；不生长者溶液澄清，以“-”表示。 （6）计算系数值 找出在5分钟生长，而在10分钟和15分钟均不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释度，计算二者的比值。例如石炭酸在10分钟内杀死大肠杆菌的最大稀释度是1：70，来苏尔是1：250，则来苏尔的石炭酸系数为250/70=3．6。 五、实验报告 1、结果 　（1）各种化学药品对金黄色葡萄球菌的致死能力 (2)石炭酸系数的测定和计算 来苏尔对大肠杆菌的石炭酸系数是多少？ 六、思考题 化学药剂对微生物所形成的抑菌圈未长菌部分是否说明微生物细胞已被杀死？