不同启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影响-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 中文摘 中文摘要 万方数据 万方数据 摘 要 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。最初的重组表达是通过大 肠杆菌分别表达出胰岛素的A链和B链。现在，胰岛素作为重组蛋白产品，主要有两 条途径获得。一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过溶解和复性等 过程获得胰岛素。另外一条途径是通过酵母表达系统，分泌表达可溶性的胰岛素前体 进入培养液。由于对酿酒酵母大规模培养有丰富的经验，使其成为了第一个分泌表达 胰岛素前体的酵母系统。虽然酿酒酵母仍然是主要的胰岛素产品表达系统，近些年几 个备选的表达系统也提供了可能性。其中，毕赤酵母是一种非常有用并且优势明显的 表达宿主。尤其是它强有力的醇氧化酶(Alcoholoxidase ，AOX) 启动子，受甲醇严格 诱导调控，通过简单培养可以达到较高的细胞密度，能够稳定且高水平表达外源蛋白。 研究目的：构建含短 C 肽 AAK 的人胰岛素原类似物 DesB30(HMPIDesB30 Human Mini-proinsulin DesB30)的毕赤酵母表达系统，即 pPIC9K- HMPIDesB30/ GS115、 pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115、pPIC9K-pGAPZαA- HMPIDesB30/ GS115,通过摇 瓶实验筛选出表达量高的工程菌株 FJ-H1、FJ-H2、 FJ-H3。优化发酵条件，考察不同 启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影响。 研究方法：构建重组质粒 pGAPZαA- HMPIDesB30 和 pPIC9K- HMPIDesB30。 分别用 AvrII 酶和 SacⅠ酶线性化 pGAPZαA- HMPIDesB30 和 pPIC9K- HMPIDesB30 并电转化毕赤酵母菌株 GS115。 利用含不同浓度 Zeocin 或 G418 的平板筛选获得 多 拷 贝 重 组 工 程 菌 pGAPZ α A- HMPIDesB30/GS115 和 pPIC9K- HMPIDesB30/ GS115。将重组质粒 pGAPZαA- HMPIDesB30，经 AvrII 酶单酶切线性化后，电转化 至经质粒 pPIC9K- HMPIDesB30 异 位 整 合 的 胰 岛 素 原 分 泌 菌 株 pPIC9K - HMPIDesB30／GS115,获得工程菌株 pPIC9K-pGAPZαA- HMPIDesB30/ GS115。分别 进行摇瓶表达 HMPIDesB30 并筛选高表达菌株 FJ-H（1 pPIC9K- HMPIDesB30/ GS115）、 FJ-H2（pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115）、 FJ-H3（pPIC9K-pGAPZαA- HMPIDesB30/ GS115），进行发酵工艺的研究。 研究结果：FJ-H3 菌株的表达量最高，可达到 1.6 g/L，分别为 FJ-H1（1.0 g/L） 的 1.6 倍和 FJ-H2（0.3 g/L）的 5.3 倍。说明应用 AOX1 和 GAP 双启动子共表达体 系能够提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。将 FJ-H3 表达的胰岛素前体纯化和 酶切回收，通过 12% Tricine SDS、质谱和肽图分析出 HMPIDesB30 的分子量 与理论分子量相符，FJ-H3 表达的目的蛋白均一、正确。 结论：本研究实现了含短 C 肽的人胰岛素原类似物 HMPIDesB30 在毕赤酵母中 I 重庆理工大学硕士学位论文 重庆理工大学硕士学位论文 的高效分泌表达，考察了不同启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影 响。应用 AOX1 和 GAP 双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达 量。 FJ-H3 菌 株 的 表达 量 最 高 ， 可达 到 1.6 g/L，并且其 分泌表达的重组蛋白 HMPIDesB30 未出现糖基化，未形成二聚体和多聚体，并具有生物学活性。本研究 确定了 FJ-H3 的发酵条件，纯化工艺简单且回收率高，终产品经鉴定正确。 关键词：胰岛素， 发酵， 毕赤酵母， 启动子 II 英文摘 英文摘要 Abstract Insulin was the first recombinant product approved by the FDA for human application . The first expression systems were based on the separate expression of the A- and B-chains fused to carrier proteins in two different E. coli strains . Nowadays, human