生长期RNAi抑制POD基因表达对心里美萝卜花青素含量的影响.docVIP

生长期RNAi抑制POD基因表达对心里美萝卜花青素含量的影响 　　【摘 要】前期结果表明，在生长期通过RNAi可有效地抑制其POD基因的长期表达，但对72h内的变化无从了解。本实验模拟心里美萝卜自然生长条件，在前期研究基础上进行RNAi干扰POD基因表达，进一步证实POD活性被抑制的时间可以提前到RNAi干扰质粒作用后的4h，而花青素的含量随POD活性被抑制而逐渐增加。同时植物的生长状态可以影响到干扰强弱，对干扰趋势影响不明显。 　　【关键词】POD rsprx1基因 RNAi 花青素 　　心里美萝卜（Raphanus sativus L）属十字花科、两年生草本植物，是我国著名的萝卜品种，其肉质根的木质部中含有丰富的过氧化物酶和花青素。过氧化物酶（Peroxidase，POD）是广泛存在于植物体内的一类能利用H2O2氧化供氢体的酶，它对H2O2具有高度专一性，而对供氢体的要求则较为广泛，它催化如下反应：AH+ H2O2=A+2H2O[1]。由于POD成分和结构的复杂性，同功酶的多样性，以及多基因编码特点，造成对其功能的认识尚不全面。POD一方面与植物正常的形态发生和形态建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆性有关，包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物重要的保护酶。 　　花青素（Anthocyanidin），又称花色素，是苯并吡喃衍生物，常与一个以上葡萄糖、鼠李糖等通过糖苷键形成花青苷（Anthocyanin）。花青素主要存在于植物液泡中，水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分与之有关，也是树木叶片的主要呈色物质。花青素具有抗氧化、消除自由基、抗变异、抗肿瘤、降低血清和肝脏中脂肪含量以及防止人体内过氧化的作用。植物花青素代谢途径研究已较为成熟，苯丙氨酸是花青素合成的直接前体，由苯丙氨酸到花青素经历3个阶段：第1阶段由苯丙氨酸到香豆酰CoA；第2阶段是由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢黄酮醇，是类黄酮代谢的关键反应；第3阶段是花青素的合成 。通过外源结构基因的导入，利用共抑制原理等技术调控花青素等类黄酮物质的合成，以改变植物花色、果色和叶色已经取得了许多成果。RNAi技术已经成功应用到通过抑制花青素合成基因来改变花的颜色，创造出新的植物品种这一领域上来。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　心里美萝卜品种为京研牌“满堂红”菌株：含有pART-rsprx1i干扰载体的农杆菌菌株和含有空载体pART-27的农杆菌菌株，由本实验室保存； 　　1.2方法 　　（1）浸染 将含有干扰载体pART-rsprx1i和空质粒pART-27的农杆菌在含有50mg/L卡那霉素（Kan）的LB固体培养基上分别划线培养，长出菌落后，挑取单菌落接种于附加50mg/L卡那霉素（Kan）的LB液体培养基中，培养48 h左右，使OD达到0.8。用含有10mmol/L MES和2%蔗糖、pH为5.6的1/2MS液体培养基做为细胞重悬液，重悬菌液至OD为2.4。取生长至65天、79天和93天的心里美萝卜去皮，灭菌后切成0.5cm3，用含有pART-rsprx1i的菌液浸泡10min，并以含有pART27的农杆菌及清水做对照，浸泡时置于摇床。浸泡后置于培养皿，在培养箱中进行培养，培养箱的光照强度为12000LX，温度为24°C。培养4h、8h、24h、48h和72h后测定各指标。 　　（2）POD活性的检测 称0.9g肉质根，加入适量石英砂及0.9 ml PB [50mmol/L （pH7.0）]，低温下匀浆，12000r/min离心20 min。参照张龙翔等方法[3]，取上清10μl，加入2.9 ml 0.01mol/L PB，并加入50μl 0.02mol/L愈创木酚，最后加入10μl 0.04mol/L新配制的H2O2后470nm处比色，每隔30秒测定OD，连续记录3min，以光吸收每分钟增加0.001为一个酶活性单位（U），酶活性用U/g?FW表示。 　　（3）花青素含量的测定 取0.3g肉质根，加少量石英砂和0.9 ml提取液（含1%浓盐酸的无水乙醇），研磨至匀浆，在4°C冰箱避光浸提24h，加等体积蒸馏水1.8 ml，12000 r/min，4°C离心10 min，于520nm处测定吸光值，含量单位用A520/g?FW表示。 　　（4）花青素高效液相色谱分析 取培养48h的萝卜肉质根，切碎后称取1g萝卜肉质根，加入2 ml的5%甲酸充分研磨，浸提12h后，8000r/m，离心15min，收集上清。HPLC使用C18柱，柱温40°C，流动相A为5%甲酸，流动相B为5 %乙腈/甲酸，流速0.4 ml/min，进样量为20 μl，检测波长为520 nm，采用梯度洗脱。 　　2结果 　　（1）生长期抑制r