干旱胁迫对金线兰POD活性及同工酶酶谱影响.docVIP

干旱胁迫对金线兰POD活性及同工酶酶谱影响 　　摘要：对生长一致的金线兰组培苗进行干旱胁迫试验，采用分光光度法和同工酶电泳技术分别研究了干旱胁迫期间金线兰POD活性及同工酶酶谱的变化。结果表明：干旱胁迫下，金线兰POD活性呈现“M”形的变化规律，同工酶条带数量发生改变，在胁迫的前2d，在“-”区产生4条新的酶带，表明在干旱胁迫下，金线兰试管苗迅速诱导POD新酶带以适应胁迫环境。胁迫3d，酶带条数减少到5条，与此同时POD活性也降到最低。从胁迫后4d起，在“+”区产生2条新的酶带。这可能是POD同工酶的表达基因有部分关闭或开启，导致酶带条数的增减。 　　关键词：干旱胁迫；金线兰；同工酶酶谱 　　中图分类号：Q945.78文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0208-02 　　干旱胁迫导致植物体内产生大量的活性氧，活性氧可以导致蛋白质、膜脂、DNA及其他细胞组分严重损伤[1-3]。在植物的抗氧化酶系统中，POD能将H2O2分解为无害的H2O和O2，降低细胞内活性氧的浓度，对维持植物正常的生理功能具有重要意义[4-6]。金线兰[Anoectochilusroxburghii（Wall.）Lindl]，别名花叶开唇兰，为兰科开唇兰属植物[7]，生活在阴湿环境中，干旱胁迫对金线兰的伤害较其他逆境严重。目前，金线兰组培快繁已经取得成功，已经进行工厂化生产，但是有关金线兰组培苗抗旱的研究鲜见报道，本试验对干旱胁迫下金线兰的POD活性和同工酶变化进行研究，为进一步了解干旱胁迫条件下金线兰的生理响应机制提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　材料为生长一致的金线兰组培苗，由贵州师范大学生命科学学院培养室提供。 　　1.2方法 　　取出金线兰组培苗，无菌水将幼根冲洗干净，放入MS营养液中适应性培养3d，再移入含不同浓度PEG6000的溶液中进行根际干旱胁迫处理。PEG6000的干旱胁迫设4个浓度处理：10%（处理Ⅰ）、20%（处理Ⅱ）、30%（处理Ⅲ）、40%（处理Ⅳ），每种处理重复3次。同工酶分析选择20%PEG6000处理的金线兰组培苗，培养温度为（23±2）℃，每天光照12h（08：00―20：00），光照强度为3000lx。 　　1.2.1粗酶液的制备准确称取成熟鲜叶0.50g，加入预冷的酶提取液（50mmol/LpH值7.8磷酸缓冲液内含0.1mmol/LEDTA，0.3%TritonX-100，4%PVP）5mL，冰浴充分研磨，于冷冻离心机（4℃）12000r/min离心20min，上清液即为粗酶液，冷藏备用。 　　1.2.2过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法[8]，3.0mL反应混合液（50.0mmol/L磷酸缓冲液500mL中含0.28mL愈创木酚和30%的H2O20.19mL）中加入50.0μL酶液，迅速摇匀，测D470nm。每30s读数1次，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，单位为U/（min?g）。 　　1.2.3电泳 　　1.2.3.1加样 　　浓缩胶聚合之后，小心拔出梳子，用滤纸条吸干梳孔中的水分，并注入预冷已稀释10倍的电极缓冲液。从冰箱冷冻室中取出样品，4℃下解冻，待样品解冻后，用微量进样器吸取80.0μL酶液，小心注入梳孔底部，同时记录样品号和相应的样品槽号，加入1滴0.1%的溴酚蓝指示剂。将电泳槽小心移入4℃冰箱中电泳。电泳条件：120min前电泳电压100B，120min后电泳电压200B，电泳时间22h。 　　1.2.3.2过氧化物同工酶染色 　　胶电泳完毕并经双蒸水冲洗3次后，在染液（0.1g联苯胺，5.0mL无水乙醇，10.0mL1.5mol/L乙酸钠，10.0mL1.5mol/L乙酸）中加入6～10滴30%的H2O2，迅速摇匀后倒在凝胶上，并将染色盒置于水平摇床上，室温下轻微摇动。待橙黄色酶带完全出现（约15min）后，倒出染色液，自来水冲洗，数码相机拍照后放入7%乙酸中保存。 　　2结果与分析 　　2.1干旱胁迫对金线兰组培苗叶片过氧化物酶（POD）的影响 　　由图1可知，干旱胁迫下不同处理叶片POD活性总体上呈现“M”形的变化规律，处理1在处理后2d，达到第1个峰值，达152.94U/（min?g），胁迫3～4d逐步降低，胁迫5～6d再次升高，到胁迫6d达第2个峰值。处理2、处理3、处理4的第1个峰值在胁迫3d出现。胁迫3～5d逐步降低，胁迫5d达最低，胁迫6d又迅速升高，达第2个峰值，胁迫7d再次下降。各处理第1次的峰值大于第2次的峰值，第1次峰值的大小顺序依次为：处理2[298.098U/（min?g）]处理4[232.888U/（min?g）]处理3[195.584U/（min?g）]处理1[152.941U