弗氏柠檬酸杆菌SYBRGreenⅠ荧光定量PCR诊断方法建立及耐药性分析.docVIP

弗氏柠檬酸杆菌SYBRGreenⅠ荧光定量PCR诊断方法建立及耐药性分析 　　摘要：根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA基因序列，设计1对特异性引物，PCR扩增弗氏柠檬酸杆菌ompA基因片段，T克隆到pMD-18T载体上构建标准阳性质粒。通过SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件优化，建立弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法，结果显示重复性好、特异性高，灵敏度可达1.0×101拷贝/μL，说明建立的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法适合于弗氏柠檬酸杆菌病临床疑似病料样品的快速诊断。对分离得到的83株弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验，结果表明冷水鱼养殖中耐药性问题日益严重。 　　关键词：弗氏柠檬酸杆菌；荧光定量PCR；快速诊断；耐药性 　　中图分类号： S855.1+2 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）11-0286-04 　　弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）是革兰氏阴性菌、短杆菌，该菌在水体、土壤中广泛存在，是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症[1-3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鲟鱼、大鲵。随着冷水鱼养殖场（户）集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前，弗氏柠檬酸杆菌感染的病害报道主要集中在鲟鱼、虾、中华鳖，而鳟鲑鱼、大鲵报道较少。感染该菌的鲟鱼、虾、中华鳖、鳟鲑鱼和大鲵出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状[4-7]。传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果。荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。本研究根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA序列，设计1对特异性引物，PCR扩增出ompA基因片段，克隆到pMD-18T载体上，构建阳性标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化，建立弗氏柠檬酸杆菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法，以期对弗氏柠檬酸杆菌临床疑似病样进行快速检测和诊断。同时，对冷水鱼养殖场分离得到的弗氏柠檬酸杆菌进行耐药性分析，为探讨防治弗氏柠檬酸杆菌病提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验菌株包括弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌，由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。 　　主要试剂包括普通PCR酶、SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR酶、核酸染料Goldview、1×TAE电泳缓冲液、DL2000、DH5α感受态细胞、细菌基因组DNA提取试剂盒、PBS缓冲液等、pMD-18T连接载体，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；药敏试纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；其他为国产分析纯试剂。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 引物设计 根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA序列，设计1对引物，上游引物为5′-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3′，下游引物为5′-TCTGGGGTCTCCTTCGTAAATGC-3′，预计扩增产物大小为117 bp，引物为生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　1.2.2 核酸的提取 　　1.2.2.1 组织样品 取患病冷水鱼肝脏组织约2.0 g，加入0.1 mol/L PBS缓冲液5 mL进行研磨，然后置于-70 ℃低温冰箱中反复冻融3次，5 000 r/min离心5 min，取上清液 970 μL 加入10% SDS 20 μL，20 mg/mL蛋白酶K 10 μL，55 ℃ 孵育30 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液200 μL，用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组。 　　1.2.2.2 细菌样品 细菌样品DNA的提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。 　　1.2.3 pMD-18T- fre阳性标准品的制备 通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌ompA基因片段，PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火温度55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。将扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T-fre，同时送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-fre在260、280 nm处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释。 　　1.2.4 荧光定量PCR反应条件的优化 荧光定量PC