原位杂交凋亡检测技术标准.pptVIP

乳腺癌细胞质PR mRNA(+), ISH 脑星形细胞瘤 血小板生长因子 mRNA（+）， ISH 3、 阳性信号的评定（半定量）： （1）阳性细胞数：阳性细胞 ≤10% 、 ≤30%、≤ 70%和70%分别为 1、 2、 3、4分。 （2）阳性着色强度：按弱、中、强三 级分别为 1、2、3分。 4、 用计算机辅助的图像分析、显微分光度计或图像分析仪对不同类型核酸显色数量和强度进行检测。 七、原位杂交结合免疫组织化学双标记法： 原位分子杂交检测DNA或RNA，能进行基因定位或在转录水平上研究基因表达； 免疫组织化学检测细胞和组织内蛋白抗原 成分，在翻译水平上研究基因表达。二者 结合起来，形成一个新的分子检测系统， 对于深入研究基因扩增、表达的调控与疾 病的发生机理有广泛的应用前景。 注意事项： 1、先做原位杂交（因mRNA易被降 解），后做免疫组化。 2、做原位杂交时应适当减低漂洗温度， 以减少生物活性肽或蛋白的丢失。 3、原位杂交完成后不显色，在加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体时混入免疫组化的第一抗体。 4、用上述方法必须是双酶双标，即分别用硷性磷酸酶和辣根过氧化物酶。 5、用不同的显色液，一般先用DAB, 后用 CIP/NBT显色，分别显成棕黄色和紫蓝色。 6、阳性细胞可为棕或蓝单色或为蓝棕混合色。 肾小管细胞核HBVDNA，细胞质 HBsAg 双（+），ISH-IHC 肝细胞HBVDNA ，HBsAg 双（+）， ISH-IHC 原位杂交是一个很复杂的操作过程，许多条件不好掌握。尤其对初作此项工作的人往往面对失败而束手无策；但目前国际、国内许多公司已推出一系列成套的原位杂交检测试剂盒，可方便使用。 试剂盒内包括：蛋白酶K，含标记探针的杂交液，封闭液及检测系统等主要试剂；由于每种试剂都经过最优化检测后配制， 所以成功率高，操作也简便，使原位杂交在一般实验室进行成为可能。 The End 细胞凋亡检测技术 一 、前言：凋亡（Apoptosis） 程序性细胞死亡 （programmed cell death, PCD） 细胞自身的一种主动的生理性死亡过程，一种不同于坏死的死亡方式；是由基因控制的细胞自我消亡过程。 光学显微镜HE染色观察凋亡细胞： 核染色质浓缩、碎片形成（为时已晚）。 原位末端标记凋亡细胞：可有或无上述特征（早期观察）。 *细胞凋亡时内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’—OH末端；利用末端脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP结合在3’—OH末端，再通过酶联反应，最后用显色剂予以显色。 二、凋亡检测技术： 1、原位细胞凋亡； 2、凝胶电泳； 3、流式细胞术； 4、激光扫描。 三、凋亡细胞的形态学： 普通光学显微镜下形态： 1、组织处理：一般无特殊。 （1）培养细胞应低速离心（250r/min）5分钟，避免破碎。 （2）防脱片：1%牛血清白蛋白、卵蛋白、处理玻片。 2、染色方法： （1）普通HE染色； （2）Giemsa 染色； （3）Mayer苏木素。 3、细胞形态： （1）凋亡细胞：体积缩小，胞浆浓缩、 红染，核固缩深染或碎裂。 （2）凋亡小体（嗜酸性小体）：被巨噬细 胞或上皮细胞吞噬或游离的凋亡细胞。圆形 或卵圆形、大小不等，胞浆浓缩，强嗜酸性， 可有或无固缩深染的核碎片。 食管鳞癌细胞系TUNEL染色 食管鳞癌细胞系石蜡切片HE染色 （三）防止RNA酶污染： ? ??1、整个实验过程均需戴消毒手套。 2、实验用玻璃器皿在实验前一日置高 温 （2400C）烘烤，以破坏RNA酶。 ? （四）、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： 1、Triton X-100 2、蛋白酶K（Proteinase K 1ug/ml） 37 0C 15~20 min 3、胃蛋白酶（Pepsin 20~100ug/ml） 37 0C 30 min